禽源肺表面活性蛋白A靶向抗禽致病性大肠杆菌感染的作用机制研究

Chicken surfactant protein A (cSP-A) is a hydrophobic and membrane surface glycoprotein believed to play an important role in innate immunity against microorganism infection. Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is a main pathogenic bacteria causing respiratory infection. However, no one article that study cSP-A against APEC infection. In order to study the mechanism of cSP-A targeting against APEC infection, firstly, the anti-cSP-A nanobodies will be screened by using the solid-phase method of phage antibody library. Secondly, the target sites of cSP-A in the respiratory tract of chicken will be observered by animal living imaging technique. Thirdly, in order to confirm the functional domains of cSP-A recognizing APEC, the cell lines that deletion of different functional regions or motif were constructed to observe the adhesion between the cell lines and APEC. By establishing models of macrophage cell line and SPF chickens infected with APEC, the mechanism of cSP-A exerting its anti-APEC effect through inhibiting the activity of NF-κB in the TLR4-NF-κB signaling pathway will be explored.This research will provide a new perspective for the lung-targeting against APEC infection.

禽源肺表面活性蛋白A（cSP-A）是来源于鸡肺上皮细胞分泌的一种亲水性、膜表面糖蛋白, 具有抗病原微生物的天然免疫功能。禽致病性大肠杆菌（APEC）是引起家禽呼吸道感染的主要病原菌，而有关cSP-A抗APEC感染的研究尚未见报道。为探讨cSP-A肺部靶向抗APEC感染的作用机制，首先，拟通过构建噬菌体纳米抗体文库，筛选抗cSP-A纳米抗体；继而，利用cSP-A纳米抗体，通过活体荧光成像技术确定cSP-A作用于鸡呼吸系统的靶点；然后，构建cSP-A单独缺失不同功能区的稳定细胞株，观察各细胞株与APEC的粘附情况，分析抗APEC的cSP-A结构域；最后，通过建立APEC感染鸡巨噬细胞系模型和雏鸡APEC肺感染模型，分别从细胞水平和活体水平探明cSP-A通过抑制TLR4-NF-κB信号途径抗APEC的作用机制，为靶向抗APEC感染提供新思路。

肺表面活性蛋白A是来源于动物肺上皮细胞分泌的一种亲水性膜表面糖蛋白。最近研究表明鸡肺表面活性蛋白A (chicken surfactant protein，cSP-A)分为cSP-A1和cSP-A2 (cSP-A1旧称鸡肺凝集素，cSP-A2旧称鸡肺表面活性蛋白A)。通过建立SPF雏鸡肺部感染模型，发现禽致病性大肠杆菌Escherichia coli (E.coli)AE17(O2)感染SPF鸡2小时后，其肺和气管cSP-A1和cSP-A2基因及其蛋白均上调，说明二者在鸡呼吸系统存在共调控机制，并可能在雏鸡感染E.coli初期发挥重要的天然免疫功能。 .应用293F细胞表达2种可溶性蛋白，经Ni2+柱纯化后重组cSP-A1和cSP-A2 (RcSP-A和RcSP-A2)蛋白产量分别达9mg/L和2mg/L。凝集试验结果显示RcSP-A1(50μg/mL)和RcSP-A2(100μg/mL)对E.coli AE17、金黄色葡萄球菌和鸡白痢沙门氏菌等菌株均有凝集作用，其中RcSP-A1还可抑制E.coli AE17和金黄色葡萄球菌的生长。将RcSP-A1(50μg/mL)诱导鸡巨噬细胞(HD11) 6小时后发现其白介素8，10和1β基因mRNA显著上调，转录组测序发现其差异表达基因主要在NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路及IL-17信号通路中显著富集，推测cSP-A1刺激鸡巨噬细胞可激活多种免疫信号通路，并通过影响基因表达的上调或下调来调节免疫应答。 .通过昆虫杆状病毒系统表达鹅肺表面活性蛋白A (goose surfactant protein A，gSP-A)， .经Ni2+柱纯化获得8.9mg/LgSP-A，100μg/mLgSP-A对16株E.coli均有不同程度的凝集作用，其中gSP-A处理的E.coli O2和O78在2-6小时生长缓慢，且随着gSP-A浓度增加，其运动性减弱，膜渗透性增加，表明gSP-A能够通过凝集依赖性机制经降低运动性和增加膜通透性来降低某些血清型E.coli的活力。这些结果将有助于详细研究禽源SP-A在天然免疫防御中的作用以及抗菌药物的开发。