响应调控蛋白AbsR促进禽致病性大肠杆菌体内适应性的分子机制

Two-component signaling systems (TCSs) are used by bacteria for adapting to a wide range of environments. In many pathogenic bacteria, TCSs are involved in regulation of virulence expression, and thus are potentially druggable targets. Previously, we have shown that a TCS response regulator AbsR promotes APEC's survival in duck blood in vivo. However, the mechanism by which AbsR affects pathogenicity remains unknown. In this study, we will first use comparative transcriptomics to profile differentially expressed genes between wild type strain of APEC XM and the mutant APEC XM ΔabsR; then we will use Chromatin Immunoprecipitatation and bioinformatic genome-wide search to identify binding regions of AbsR; based on a combinatorial analysis of these data mentioned above, we will be able to define the regulon of AbsR. Further, we will select virulence/in vivo fitness-associated genes and study the molecular mechanisms underlying AbsR's regulation with electrophoretic mobility shift assay and protein pull-down assay. Also, physiological impacts on bacteria in vitro of AbsR's regulation will be determined, such as acid resistance and iron uptake. Lastly, we will reveal the mechanism by which AbsR contributes to fitness of APEC, using a macrophage cell model and avian infection model. Collectively, this study will help understand AbsR system, provide mechanistic basis for developing potential interventions, and supply a toolbox for investigating TCSs in bacterial pathogens.

双组份调控系统能够调控病原菌毒力因子的表达，是抗菌制剂的潜在靶点。前期结果显示：双组份调控系统中的响应调节蛋白AbsR能够促进禽致病性大肠杆菌在宿主血液内的存活。但是，AbsR发挥作用的机制还不清楚。本研究将利用比较转录组学方法得到ExPEC XM与ExPEC XMΔabsR的差异表达谱；然后利用染色质免疫共沉淀等方法，鉴定AbsR在基因组中的结合区；对两部分数据联合分析，得到全面的AbsR调控元。选取富集倍数高且对细菌致病力有潜在重要作用的靶基因，利用凝胶阻滞试验、蛋白Pull-down等方法，揭示AbsR的分子调控机制。更进一步，研究AbsR对靶基因的调控如何影响生理功能，如铁离子的利用等。最后，通过巨噬细胞模型和雏鸭感染模型，全面阐明AbsR如何通过靶基因促进禽致病性大肠杆菌在宿主体内存活。本项目将揭示AbsR系统的分子调控和致病机制，为评估开发针对AbsR的干预措施奠定理论基础。

禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli, APEC）是一类引起鸡、鸭等禽类急性感染的肠外致病性大肠杆菌。APEC感染能够导致全身性、多组织器官的病变，以气囊炎、心包炎、败血症等为主要临床症状。禽大肠杆菌病在我国多地区常发，其传播迅速，严重危害我国养禽业发展，造成巨大经济损失。本实验室之前的研究表明，缺失absR严重影响APEC在动物血液里定植，absR缺失株感染宿主动物不会导致死亡，而野生型菌株感染导致的死亡率则为100%（Zhang et al, Infection and Immunity, 2019）。但是，AbsR影响APEC毒力的机制并不清楚。本研究首先对AbsR进行RNA-seq和ChIP-seq联合分析，发现AbsR调控至少150个基因的表达；其中，约99个基因被AbsR直接调控。在靶基因中，选择被影响程度高的基因进行进一步研究。我们发现，AbsR直接正调控酸感应系统EvgSR和二型分泌系统（T2SS）基因，分别影响抗酸能力和蛋白分泌与生物膜形成能力，但是这些靶基因在动物感染模型上的作用很有限。相对而言，AbsR直接正调控荚膜合成，而荚膜可以抵御巨噬细胞的吞噬和血清中补体的杀伤；另外，荚膜的缺失和absR的缺失对APEC在动物模型上的毒力致弱程度相似。因此，本项目揭示了AbsR影响毒力的重要机制，即主要通过影响荚膜合成，进而降低抗巨噬细胞吞噬能力和抗血清杀伤能力而影响毒力。本研究的另外一个重要发现为，AbsR严重抑制I-F CRISPR系统基因的表达，这可能解释了为什么大肠杆菌中I-F系统一般处于不发挥作用（inactive）的状态；而我们的数据暗示，这种调控很可能是间接的，其中的具体的分子调控机制有待进一步解析；本课题组希望能够获得进一步的支持，以更好的解析从本项目中衍生出来的新的发现。