CRISPR/Cas系统如何获取新间隔序列的作用机理研究

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas complex is essential for the adaptive immune system in microbes to defense against invading nucleic acids from phages or plasmids. While the molecular mechanisms of crRNA expression and interference steps are now well characterized in molecular and functional terms, the adaptation step still awaits detailed analysis. Several fundamental questions then arise as to how CRISRP/Cas system acquire new spacers from invasive nucleic acids. How the protospacer was integrated into the CRISPR array in type I CRISPR/Cas system. Moreover, how the composition and the mechanism of adaptation complex in type II CRISPR-Cas system need further studies. In this project, we will work on the structures and mechanism of Cas proteins and DNA complex in adaptation stage, using x-ray crystallography and electron microscopy, combined with single molecule and biochemical techniques in type I and II CRISPR/Cas system. We will analyze the function of Cas1-Cas2 complex in DNA recognition and protospacer integration, and solve the structure of Cas1-Cas2-Cas9-Csn2 complex to reveal the molecular mechanism of spacer acquisition in CRISPR/Cas systems.

CRISPR/Cas系统作为一种获得性免疫系统，保护细菌和古菌免受噬菌体和质粒的入侵。人们对CRISPR/Cas系统中crRNA的加工成熟以及识别与降解外源核酸的机理进行了大量的研究，并对干扰阶段的核心复合物有了深入的了解。但是，获取阶段的机制仍不十分清楚。I型系统间隔序列前体如何整合到CRISPR位点，II型系统中获取复合物的组成以及作用机理都需要进一步研究。在本项目中，我们将运用x-射线晶体学与电镜，并结合单分子与生物化学等技术手段，以I型和II型CRISPR/Cas系统为代表，深入研究获取阶段的Cas蛋白与核酸复合物的结构及功能，分析Cas1-Cas2复合物识别底物DNA的方式，在间隔序列前体整合时发挥的作用机理，我们还将研究在II型系统中Cas1-Cas2-Cas9-Csn2复合物的组装方式以及在获取外源核酸时各自发挥的作用，最终阐明CRISPR/Cas系统获取间隔序列的分子机理。

CRISPR-Cas系统 是原核生物中广泛存在的一种由RNA介导的获得性免疫系统。其不仅是原核生物的一种免疫系统，而且被开发为基因编辑工具被广泛应用。人们对CRISPR-Cas系统中crRNA的加工成熟以及识别与降解外源核酸的机理进行了大量的研究，并对干扰阶段的核心复合物有了深入的了解。但是，获取阶段的机制仍不十分清楚。I型系统间隔序列前体如何整合到CRISPR位点，II型系统中获取复合物的组成以及作用机理都需要进一步研究。在本项目中，我们以I型和II型CRISPR-Cas系统为代表，深入研究获取阶段的Cas蛋白与核酸复合物的结构及功能，分析Cas1-Cas2复合物识别底物DNA的方式，在间隔序列前体整合时发挥的作用机理，我们还研究了在II型系统中Cas1-Cas2-Cas9-Csn2复合物的组装方式以及在获取外源核酸时各自发挥的作用，最终阐明了CRISPR-Cas系统获取间隔序列的分子机理。. 此外还解析了多种噬菌体防御系统Anti-CRISPR效应蛋白的结构，并通过生化实验阐明噬菌体AcrIIC2、AcrIIC3抑制CRISPR免疫系统的作用机制。在基金的支持下，本项目还阐释Ago蛋白容纳miRNA靶链之间突起和错配的机理，并阐明细菌Ago蛋白参与DNA活性的关键氨基酸功能；还解析CTCF-DNA复合物的晶体结构，揭示了CTCF识别人类基因组中序列多样性的机理。