CRISPR/Cas系统中Cas3的结构及功能研究

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas (CRISPR-associated) system, which is similar to RNA interference system in eukaryotes, is a recently detected resistance mechanism of prokaryotes to defend themselves against invaders, such as plasmids, transposable elements and viruses. In this project, we will investigate the crystal structure and function of cas3 in CRISPR-Cas system, based on our research in the RNA interference system. The full-length Cas3 protein will be expressed and purified, and the crystal structures of Cas3 protein and Cas3-DNA complex will be resolved by X-ray diffraction. These results will show that how Cas3 execute its function as helicase and endonuclease in CRISPR-Cas system. Also we will compare the structure of Cas3 with the proteins in RNA interference system using bioinformatics to investigate the similarity and difference between CRISPR-Cas system and RNA interference system. These studies will bring us a deeply understanding of how prokaryotes defend themselves against invaders and the immune system evolution from prokaryotes to eukaryotes.

CRISPR-Cas系统是近几年新发现的一种原核生物免疫防御系统，其以一种类似于真核生物中RNA干扰（RNAi）系统的机制，在原核生物抵抗入侵噬菌体和外来质粒的过程中发挥着重要作用。本项目在对真核生物RNAi系统相关蛋白的结构和功能研究的基础上，开展对原核生物CRISPR-Cas系统中核心蛋白Cas3结构及其生物学功能的研究。本研究拟通过原核表达纯化Cas3蛋白，并采用结构生物学方法解析Cas3自由蛋白及Cas3-DNA复合物的晶体结构，从而揭示Cas3蛋白在CRISPR-Cas系统中发挥解螺旋、剪切等生物学功能的分子机制；通过生物信息学方法将Cas3蛋白与RNAi系统中发挥相似功能的蛋白进行结构比对，寻找原核生物CRISPR-Cas系统和真核生物RNAi系统的相似性和差异性。以上研究对深入了解原核生物免疫防御系统发挥功能的机制以及对认识原核生物界乃至整个生物界的进化和特性都有重要的意义。

CRISPR/Cas系统作为一种获得性免疫系统，保护细菌和古菌免受噬菌体和质粒的入侵。人们对CRISPR/Cas系统中crRNA的加工成熟以及识别与降解外源核酸的机理进行了大量的研究，并对干扰阶段的核心复合物有了深入的了解。但是，获取阶段的机制仍不十分清楚。I型系统间隔序列前体如何整合到CRISPR位点，II型系统中获取复合物的组成以及作用机理都需要进一步研究。. 本项目在对真核生物RNAi系统相关蛋白的结构和功能研究的基础上，开展对原核生物CRISPR-Cas系统中核心蛋白Cas3结构及其生物学功能的研究。本研究拟通过原核表达纯化Cas3蛋白，并采用结构生物学方法解析Cas3自由蛋白及Cas3-DNA复合物的晶体结构，从而揭示Cas3蛋白在CRISPR-Cas系统中发挥解螺旋、剪切等生物学功能的分子机制；通过生物信息学方法将Cas3蛋白与RNAi系统中发挥相似功能的蛋白进行结构比对，寻找原核生物CRISPR-Cas系统和真核生物RNAi系统的相似性和差异性。以上研究对深入了解原核生物免疫防御系统发挥功能的机制以及对认识原核生物界乃至整个生物界的进化和特性都有重要的意义。另外，我们以I型和II型CRISPR/Cas系统为代表，深入研究获取阶段的Cas蛋白与核酸复合物的结构及功能，分析了Cas1-Cas2复合物识别底物DNA的方式，在间隔序列前体整合时发挥的作用机理，最终阐明CRISPR/Cas系统获取间隔序列的分子机理。