anti-CRISPR蛋白对II型CRISPR-Cas系统抑制作用的分子机制研究

CRISPR-Cas systems provide bacteria and archaea with adaptive immunity against phages and plasmids. However, proteins that suppress CRISPR–Cas immunity have recently been discovered in phages. These anti-CRISPR proteins bind and inactivate key components of CRISPR–Cas systems. Studies have gained insight into the mechanism of inhibition of type I CRISPR-Cas system with bacteriophage proteins. Whereas, the molecular mechanism of suppression of type II CRISPR-Cas system by anti-CRISPR proteins has still been an unresolved question. The way that how the AcrII proteins recognized and bound to the Cas9 in type II CRISPR-Cas system, the abortion of Cas9 target binding in the presence of AcrII proteins and the mechanism of AcrII-Cas9-sgRNA complex in type II CRISPR-Cas system need further research. In this project, we will work on the structure and mechanism of anti-CRISPR proteins switching off the type II CRISPR-Cas system, using x-ray crystallography and electron microscopy, combined with biochemical techniques. We will analyze the interaction between AcrII and Cas9; solve the structure of AcrII-Cas9-sgRNA complex to reveal the molecular mechanism of anti-CRISPR against the type II CRISPR-Cas system.

CRISPR-Cas系统作为原核生物的获得性免疫系统，能够保护细菌和古菌免受噬菌体和质粒的入侵。然而，最近在噬菌体中发现一些能够抑制CRISPR-Cas免疫能力的蛋白，这些anti-CRISPR蛋白可以结合并失活CRISPR-Cas系统中的核心组分。人们对其抑制I型CRISPR-Cas系统的机制进行了深入的研究。但是，anti-CRISPR蛋白对II型CRISPR-Cas抑制作用的分子机制仍不是十分清楚，AcrII蛋白如何识别并结合到Cas9，由AcrII结合导致Cas9无法结合靶标的作用机理都需要进一步研究。在本项目中，我们将运用x-射线晶体学与冷冻电镜，并结合生物化学等技术手段，深入研究AcrII蛋白与Cas9的相互作用与结合方式，解析AcrII-Cas9-sgRNA复合物的结构，最终阐明anti-CRISPR蛋白抑制II型CRISPR-Cas系统的分子机制。

CRISPR-Cas系统 是原核生物中广泛存在的一种由RNA介导的获得性免疫系统。其不仅是原核生物的一种免疫系统，而且被开发为基因编辑工具被广泛应用。在细菌与噬菌体长期的进化过程中，噬菌体也相应的进化出了自己的防御系统（Anti=CRISPR）。本项目综合结构生物学、分子生物学等多种方法，对噬菌体的Anti-CRISPR蛋白抑制CRISPR-Cas系统的作用机理进行了研究。解析了NmeCas9的五种不同的状态的高分辨率结构。同时揭示了两种不同的NmeCas9识别两种不同PAM的分子机制，还解析了AcrIIC2和结合了NmeCas9-BH domain的的AcrIIC2复合物晶体结构，系统阐述了AcrIIC2抑制Cas9系统的分子机理；并解析了AcrVA2及其复合物的晶体结构。本项目还针对二大类CRISPR-Cas系统的蛋白进行了结构研究。解析了不同状态的III-A型CRISPR-Cas系统效应复合物Csm的结构，并结合体内和体外的功能实验，系统地阐述了 III 型CRISPR-Cas系统抵御外源核酸的分子机制。还解析了V-I亚型CRISPR-Cas系统效应蛋白Cas12i2-crRNA和Cas12i2-crRNA-DNA复合物的晶体结构，揭示了Cas12i2 对DNA的识别和切割机制。这些研究能帮助理解噬菌体和细菌之间的相互作用机制，而且还为开发新的基 因组编辑工具以及RNA研究工具提供理论依据。