来源于Arthrobotrys sp.CX1的GH61蛋白作用结晶纤维素分子的机制研究

Efficient degradation of avicelis a key technological bottleneck limiting efficient conversion of cellulose derived biofuels. Recently, a series of studies demonstrated that enzymes, termed Glycoside Hydrolase 61 family(GH61),was capable of degrading avicelis though an oxidative mechanism. However, due to inability to get GH61 complex structure, the study molecular mechanism process has been hampered by the unclear the binding and active site. To solve this problem, the GH61 protein from Arthrobotrys sp.CX1(GH61CX)is studied, as research object. The active site of GH61CX will be predicted by computational modeling and docking simulation. Subsequent site-directed mutagenesis coupling with spectroscopic and isothermal titration calorimetry experimentations will test and verify the activity site. It is essential in delineating the detailed reaction mechanism, that the function of domain and active sites are revealed. Our work will reveal the molecular mechanism for binding and degradation of avicelis with GH61CX and will be valuable for engineering a perfect enzyme with high activity and utilization in the biorefinery remain.

结晶纤维素难以被降解是限制纤维素被高效转化利用的关键技术屏障。最近研究发现一类糖苷水解61家族蛋白(GH61)可以通过氧化作用断裂结晶纤维，但其作用分子机制尚未被研究阐明。本项目以来源于Arthrobotrys sp.CX1的GH61蛋白（GH61CX）为研究对象，研究不同组成结构域的功能作用并结合同源模建和分子对接技术模拟预测GH61CX蛋白结构与结晶纤维素底物的结合位点。利用定点突变技术理性设计改造蛋白，结合光谱及等温滴定量热法等实验分析和确定GH61降解结晶纤维素的关键位点。避开因无法得到底物和酶的复合体晶体，从而难以确定GH61家族蛋白与底物的结合部位以及关键氨基酸位点的难点，揭示其结合降解纤维素作用的过程及作用机制。本研究对于深入探索GH61蛋白机制，理性改造GH61蛋白提供理论依据，具有十分重要意义。

结晶纤维素难以被降解是限制纤维素被高效转化利用的关键技术屏障。近几年研究发现一类糖苷水解61家族蛋白（GH61）可以通过氧化作用断裂结晶纤维，但其作用分子机制尚未被研究阐明。本项目以来源于Arthrobotrys sp。CX1 的GH61蛋白为研究对象，通过序列分析找个5个GH61同源蛋白序列cxGH61A,cxGH61B,cxGH61C,cxGH61D和cxGH61E，分别构建了在大肠杆菌和毕式酵母的重组表达载体。实验表明在大肠杆菌中重组蛋白表达为包涵体，而在毕式酵母中为可溶性蛋白。以其中酶活较高的cxGH61A为研究对象，构建并重组表达了含有荧光标签的GH61蛋白催化结构域与CBM底物结合模块。分别观察独立结构域与底物的结合，实验表明CBM可更有针对性的识别并结合底物，但独立的催化结构域仍可以与底物结合并降解纤维素。通过cxGH61A同源模建模拟蛋白结构与小分子底物（纤维素四糖和纤维五糖）的分子对接，得到第19位氨基酸His和第103位氨基酸His与底物结合有关，将第19位氨基酸His和第103位氨基酸His突变为Ala，构建突变菌株，实验表明其催化活性明显降低。研究金属离子对cxGH61A的催化作用，发现催化结构域通过Cu2+催化纤维素氧化断裂。因此采用金属离子无机化固定化方法构建cxGH61A纳米花，通过激活离子Cu2+固定cxGH61A来提高其催化活性15倍。此项目为研究揭示GH61蛋白催化纤维素降解过程机制提供了理论基础，并提供了一种新型提高cxGH61A酶催化活性的固定化酶研究方法。