高稳定固定金属亲和色谱柱的制备及其稳定性的评价

The leakage of the metal ion in immobilized metal affinity chromatography (IMAC) is an urgent problem. Existing methods do not resolve this issue fundamentally. Based on our previous work, computational chemistry method is applied for selecting the stronger complexing ligands with immobilized metal ions and preparing the new type of metal chelated media with the high stability at the first stage in this project. At the second stage, frontal chromatography (FC) technology is also adopted in the project. On the one hand, the stability of the chosen complexing ligand will be demonstrated by FC technology. On the other hand, in the view of three levels including metal ion complexing ligand, protein and displacer (such as buffer pH, ionic strength and competitive agents), the adsorption equilibrium models of three levels and metal ions will be established through examining the balance properties and thermodynamic parameters of the interactions between these three levels and metal ions. The effects of these interactions on the stability of the IMAC column will be explored under the complex operating system. To ensure the stability of the IMAC column in the separation and preparation process, the simulated elution conditions will be adopted in the actual analysis for protein in order to demonstrate the feasibility of the method. The study not only provides the solutions with universal law for the leakage of the metal ions in IMAC, but also has an important scientific significance in developing new types of metal chelated ligands with higher stability and expanding the applications of IMAC in the field of preparation for food and pharmaceutical proteins.

固定金属亲和色谱 (IMAC) 中金属离子的流失是一个亟待解决的问题。现有方法均未从根本上解决该问题。在前期工作基础上，本项目首先采用计算化学方法，筛选出可与固定金属离子强配位的络合配基，制备出新型高稳定性金属螯合剂。利用前沿色谱 (FC) 技术，一方面论证初筛络合配基的稳定性；另一方面从金属离子络合配基、蛋白质、溶液环境三个层面综合出发，通过建立三者与金属离子之间的吸附平衡模型，考察三者与金属离子相互作用的平衡特性和热力学参数，探究在复杂体系下，三者与金属离子间的相互作用对IMAC柱稳定性的影响。通过上述研究，一方面凝练出具有普适性规律的解决IMAC中金属离子流失的科学问题；另一方面，将模拟出的适宜洗脱条件应用于实际蛋白的分析研究中，确保在整个分离过程中IMAC柱的稳定性，从而论证方法的可行性。该研究对开发新型高稳定金属螯合剂，扩展IMAC在食品、药用蛋白质领域的研究有着重要科学意义。

在固定金属亲和色谱（IMAC）的推广应用过程中，主要面临的问题之一是如何提高IMAC柱的稳定性。针对这一长期困扰科研工作者的难题，目前所采取的研究对策主要围绕着缓冲溶液和竞争剂、金属离子以及金属络合剂这三方面展开。然而现有方法均未从根本上解决IMAC中金属离子流失的问题，研究的方法和手段仍旧停留在实验现象的观察上，并未真正从理论意义的角度研究和探讨这一问题。. 本项目首先采用计算化学方法，筛选出可与固定金属离子强配位的络合配基。利用前沿色谱（FC）技术，一方面论证初筛络合配基的稳定性；另一方面从金属离子络合配基、蛋白质、溶液环境（如缓冲溶液的pH和离子强度、竞争剂）三个层面综合出发，通过建立与金属离子之间的吸附平衡模型，探究在复杂操作体系下，它们与金属离子之间的相互作用对IMAC柱稳定性的影响。研究结果表明：（1）采用计算化学方法，有效指导了新型高强度络合配基的筛选。在配基的筛选过程中发现，配体的齿数，金属离子的电荷数以及原子半径均对配体螯合物稳定性有影响，且五齿的IDS明显要优于常规齿数的配基如IDA，L-Glu和Asp等；Fe3+ > Cu2+ > Ni2+ > Co2+ > Zn2+ > Ca2+。（2）采用FC技术，对不同阶段研究对象吸附模型的建立具有重要的理论和应用价值。根据所建立的模型求取吸附参数K和ᴧ值，利用该参数能简单、快速地评价金属离子与配体、蛋白质之间的络合行为。从另一角度，也为高强度金属螯合配体的筛选提供了依据。（3）探索吸附平衡参数与IMAC固定相稳定性间的科学规律。金属离子与氨酸配体间的吸附平衡参数值远大于蛋白质与IMAC柱的吸附平衡参数值，即KML >> KMP。这一规律的存在就确保了高稳定性IMAC柱的制备，以及在蛋白质的竞争洗脱过程中IMAC柱的稳定性。（4）新开发的氨羧类单体和二聚体色谱填料，与传统色谱填料相比，表现出更优异的色谱特性以及极强的金属螯合特性。. 该研究对开发新型高稳定性金属螯合剂，扩展IMAC在食品、药用蛋白质制备领域的研究有着重要的科学意义。