哈氏噬纤维菌外膜纤维素结合蛋白吸附和解构结晶纤维素机理的研究

开发利用纤维素类生物能源的主要障碍是较低的结晶纤维素转化效率，揭示结晶纤维素降解机制是解决这一难题的关键。哈氏噬纤维菌具有不同于真菌游离酶系和瘤胃细菌纤维小体的第三种纤维素降解体系，能迅速彻底地降解高结晶度纤维素，但其作用机制尚不清楚。其中，菌体对结晶纤维素的吸附和解构是降解的首要步骤。我们从细胞外膜蛋白中分离和鉴定了多个不含碳水化合物结合结构域的新型纤维素结合蛋白，首次成功构建了可复制质粒并实现了对该菌的电击转化。在此基础上，本课题拟通过构建一系列结合蛋白缺陷株，从中筛选出影响菌体吸附和降解结晶纤维素的关键蛋白，通过同源和异源表达获得活性蛋白，并深入研究其吸附特性和吸附位点，初步阐明外膜纤维素结合蛋白吸附和解构结晶纤维素的机制，为揭示该菌独特高效的结晶纤维素降解策略奠定基础，为提高结晶纤维素转化效率提供指导和借鉴。

哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii）是自然界中广泛存在的一类可降解结晶纤维素的好氧细菌，它降解结晶纤维素速度较快并且彻底。与已知的好氧真菌或厌氧细菌不同的是，哈氏噬纤维菌不分泌明显的胞外纤维素酶，基因组中也未检索到纤维小体相关的同源基因，哈氏噬纤维菌利用一种未知的新型纤维素降解策略降解结晶纤维素。由于缺乏遗传操作体系，目前对哈氏噬纤维菌参与纤维素结合和降解的相关酶和蛋白均缺乏研究。哈氏噬纤维菌不分泌游离的纤维素酶，其菌体对纤维素的吸附是纤维素降解的第一步。通过序列分析发现，哈氏噬纤维菌编码的纤维素酶大都不含纤维素结合结构域CBM，基因组中也没有其他已知的纤维素结合蛋白的同源基因，推测其可能含有一些新型的纤维素结合蛋白。研究这些蛋白的功能，对揭示哈氏噬纤维菌独特的纤维素降解机制具有重要意义，也将为高效利用纤维素资源提供有益指导。. 在本课题的研究中我们首次构建了哈氏噬纤维菌比较完备的遗传操作系统，利用基于哈氏噬纤维菌的基因组复制起始序列构建的可复制的质粒成功实现了外源基因在哈氏噬纤维菌中表达和对基因敲除菌株的回补，并在此基础上建立了两步筛选的基因敲除方法，进一步建立了基于FLP-FRT重组系统的无标记单基因和基因组大片段敲除方法，这些遗传操作系统的建立为深入研究哈氏噬纤维菌的基因功能奠定了坚实的基础。利用这些技术我们筛选到多株纤维素降解缺陷突变株，通过差异蛋白组学研究鉴定了多个参与纤维素结合和降解的新型蛋白，并对其功能进行了研究。结果表明某些位于哈氏噬纤维菌表面的纤维素结合蛋白是纤维素降解所必须的，这大大丰富了我们对纤维素结合蛋白的认识。我们还发现哈氏噬纤维菌虽然缺乏外切纤维素酶，但是却具有能够结合并持续性降解纤维素的内切纤维素酶。通过研究纤维素酶晶体结构，我们首次在催化结构域中发现一些与纤维素结合密切相关的残基。这些工作对揭示哈氏噬纤维菌纤维素独特的纤维素降解机制具有重要意义。相关研究也将为纤维素的高效转化和利用提供积极的指导和借鉴。