免疫促凋亡分子Immuno-Fdt-tBid的人源化及其对HER2阳性肿瘤杀伤作用的研究

我们前期研究构建的免疫促凋亡分子是由抗HER2的单链抗体（e23sFv）、长10个氨基酸的白喉毒素的Furin识别序列（Fdt）以及截短型促凋亡分子Bid(tBid)所构成，并且证实原核表达的e23sFv-Fdt-tBid在体内和体外可以有效杀伤HER2阳性乳腺癌细胞。由于其单链抗体部分是鼠源性的，尽管其氨基酸序列与人源性抗体有70%以上的同源性，仍存在多个氨基酸位点差异，有引起机体免疫反应的可能性。因此，为了最大限度的降低整个免疫促凋亡分子的免疫原性，我们拟对e23sFv的框架区（FR）进行人源化改造，将互补决定区（CDR）移植到人抗体的FR，或者置换与人源抗体有差异的氨基酸，并检测序列改变后单链抗体结合的特异性、亲和活性和内化活性，验证改构后的免疫促凋亡分子对HER2阳性肿瘤的杀伤作用，以利于免疫促凋亡分子在人体的重复使用，为Immuno-Fdt-tBid的临床前研究奠定基础。

本课题组前期构建了免疫促凋亡分子，它由HER2单链抗体（e23sFv）、Furin识别序列（Fdt）和促凋亡分子tBid构成，可以有效杀伤HER2阳性肿瘤细胞。但由于e23sFv为鼠源单链抗体，具有引起人体免疫反应的潜在风险。为此，本项目对e23sFv进行人源化改造，并将其构建入免疫促凋亡分子，使之既可保留HER2亲和力和肿瘤特异性杀伤活性，又可降低免疫原性，有利于长期重复使用。.主要研究内容和结如下：.1.模拟分析了鼠源单链抗体e23sFv的空间结构，对其框架区采取多点突变和整体替换两种策略进行人源化改造。.2.通过对框架区13个氨基酸编码序列随机突变，建立理论容量为213的突变体抗体库，经过多轮淘选筛选出20株亲和力较高的噬菌体抗体，其中亲和力高于e23sFv的有P1h2、P1h3、P2h2和P2h5四株。其中P1h2、P1h3和P2h2可内化进入肿瘤细胞，而P2h5内化活性较弱。.3.应用ELISPOT对上述候选抗体分子进行免疫原性检测，结果显示P1h2、 P1h3和P2h2刺激PBMC产生IFN-γ的阳性细胞频率较鼠源e23sFv均有显著减少；P1h2、 P1h3和P2h2刺激PBMC产生TNF-α、IL-10和IFN-γ的水平较鼠源e23sFv均有显著降低。.4.将P1h2、 P1h3和P2h2组建表达成免疫促凋亡分子，细胞杀伤实验结果显示，人源化改造的免疫促凋亡分子可特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞，其中P1h3-Fdt-tBid较人源化改造前具有更优的活性。体内NCI-1975皮下荷瘤模型证实，人源化改造后的免疫促凋亡分子表现出与鼠源免疫促凋亡分子相当的HER2阳性肿瘤细胞杀伤能力，可有效诱导肿瘤细胞凋亡。.本研究筛选获得了的三株抗HER2人源化单链抗体，不仅免疫原性显著下降，而且以其构建的免疫促凋亡分子具有更强的HER2亲和力和肿瘤特异性杀伤活性，为下一步应用研究提供了可靠基础。.以上三株人源化单链抗体已申请国家发明专利3项，主体研究成果正在整理投稿。.