冰城链霉菌米尔贝霉素生物合成调控基因-milR作用的分子机制

Streptomyces bingchenggensis with self-owned intellectual property rights obtained in our lab generates insecticidal antibiotic, milbemycins. Its complete genome sequence has been reported and the milbemycin gene cluster was identified. Analysis of milbemycin gene cluster revealed the existence of a regulatory gene milR, whose encoded protein shows similarity to LAL family （Large ATP-binding regulator of the LuxR family）transcriptional regulators. milR is predicted to involve in milbemycin biosynthesis. By gene disruption and complementation, EMSA, foot printing, transcriptional analysis, and DNA affinity capture assay, this project will study the transcriptional regulatory mechanism of milR on milbemycin production, the interactions between milR and its target genes, a further exploration on hierarchical regulators of milR. The study is aimed to reveal the molecular mechanism of milR in milbemycin biosynthesis and pave a profound way for the construction of engineered strains with high-yield milbemycins.

以拥有自主知识产权产杀虫抗生素米尔贝霉素的冰城链霉菌为研究对象，在课题组前期完成冰城链霉菌全基因组序列和米尔贝霉素生物合成基因簇克隆基础上，分析发现米尔贝霉素生物合成基因簇中有一个LAL家族（Large ATP-binding regulator of the LuxR family）转录调控基因－milR，推测可能参与米尔贝霉素生物合成的调控。拟采用基因敲除、遗传互补、凝胶阻滞，足印实验，转录分析，DNA 亲和捕捉，对milR的转录调控以及milR与其靶基因的相互作用等方面进行深入研究，并对milR上层调控基因进行探索，阐明milR在米尔贝霉素生物合成中的分子作用机制，为构建米尔贝霉素优良菌株，提高米尔贝霉素发酵单位产量提供重要的理论依据和指导。

米尔贝霉素（milbemycin）是由冰城链霉菌产生的一种16元大环内酯类抗生素。现有的研究表明米尔贝霉素具有高效的杀螨，杀虫及抗寄生虫活性，并且对哺乳动物毒性低，对环境无害，这使得其作为植物保护农药和兽药得到了广泛的应用。开展米尔贝霉素生物合成的分子调控研究，在理论上将阐明米尔贝霉素生物合成的调控机制，并能为理性提高米尔贝霉素的产量奠定基础。基于此，本项目首次开展了冰城链霉菌米尔贝霉素的生物合成调控研究。首先，解析了米尔贝霉素的途径特异性调控机制，对米尔贝霉素的生物合成基因簇进行分析，发现存在唯一一个LAL家族（Large ATP-binding regulator of the LuxR family）转录调控基因－milR，推测可能参与米尔贝霉素生物合成的调控。研究表明MilR通过直接作用于同一基因簇中milA4-E，orf1和milF这三个转录元启动子区域而正调控米尔贝霉素的生物合成。将milR敲除后，这三个转录元的转录丰度几乎检测不到，同时簇中其它结构基因转录元转录丰度也有一定程度下降，说明MilR能够直接激活milA4-E，orf1和milF的转录，同时间接激活簇中其它结构基因。将单拷贝的milR在冰城链霉菌中进行过表达，结果表明与野生型菌株BC04米尔贝霉素产量2947 mg/l比较，过表达菌株BC04::milR产量高达4069 mg/l，产量提高约38%。其次，研究了群感效应系统SbbR/SbbA调控米尔贝霉素生物合成的分子机制。SbbR为γ-butyrolactone类型的信号分子受体，而SbbA则是信号分子合酶。通过基因敲除和回补实验证明，SbbR/SbbA在米尔贝生物合成过程中发挥着重要的作用。敲除sbbR使得米尔贝霉素产量大幅度下降，与出发菌株BC04比较，产量下降约80%，而失活sbbA则使得米尔贝霉素产量升高约25%，同时细胞生物量也下降。凝胶阻滞，转录分析和GUS报告基因系统结果表明SbbR能够通过直接激活米尔贝霉素生物合成基因簇的途径特异性调控基因milR的转录，进而激活米尔贝霉素的生物合成基因簇的表达，暗示着群感效应信号分子受体介导的级联激活信号通路可能是次级代谢调控中普遍存在的调控机制。