链霉菌多效调控子AtrA调控米尔贝霉素生物合成的分子机制

AtrA and its orthologs are well-conserved pleiotropic regulators in Streptomyces. Generally, they control secondary metabolites production via regulating the expression levels of corresponding biosynthetic genes. However, little is known about their regulation on the production of secondary metabolites via controlling precursor supply and antibiotic transporters. Milbemycins isolated from streptomycetes are used widely in agricultural and veterinary fields. Our previous study showed that overexpression of atrA significantly increased milbemycin production in the industrial strain Streptomyces bingchenggensis, while the expression levels of milbemycin biosynthetic genes showed no obvious changes; deletion of atrA led to an obvious titer improvement in the supernatant of fermentation medium. These data suggest that AtrA regulates milbemycin production by controlling precursor supply and antibiotic transporters. This project aims to find the global target of AtrA, determine the functions of related targets in milbemycin production, investigate the regulatory mechanisms of AtrA on precursor supply and antibiotic transporters, and finally reveal the molecular mechanism of AtrA on milbemycin production. This project will elucidate the molecular mechanisms of AtrA on antibiotic production from a new perspective, and provide the important theoretical basis for genetic engineering of new hyper-producer strains.

AtrA是链霉菌中保守的多效调控因子，一般通过影响抗生素生物合成基因簇的表达而调控抗生素产生，但其如何通过前体供给和抗生素外排泵调控抗生素产生未有报道。米尔贝霉素是由链霉菌产生的重要农用抗生素。课题组前期研究发现，在冰城链霉菌中过表达atrA能够显著提高米尔贝霉素产量，而相应生物合成基因簇转录水平没有显著变化；敲除atrA后，分泌到胞外的米尔贝霉素量大幅上升，表明AtrA很可能通过调节前体供给和抗生素外排相关基因而影响产素。因此本项目拟采用转录组测序，染色质免疫共沉淀，胞内代谢物分析，基因敲除、回补和过表达，凝胶阻滞以及足印实验等方法在全基因组范围内鉴定AtrA靶基因，确定靶基因功能，探究AtrA影响前体供给和外排泵的作用机制，进而解析AtrA调控米尔贝霉素合成的分子机制。本项目研究拟从一个崭新角度理解AtrA的多效调控机制，并为构建抗生素高产菌株提供重要理论指导。

米尔贝霉素（Milbemycin）是由链霉菌产生的I型聚酮类生物杀虫剂，具有高效和广谱杀虫活性、且环境友好、人畜安全，在植物保护农药和兽药具有广阔应用前景。揭示米尔贝霉素生物合成调控网络，挖掘高产有效靶点，可为高产工程菌构建提供更多选择性。本项目研究发现将来源于阿维链霉菌的atrA同源基因aveI在冰城链霉菌BC04中进行两个拷贝过表达时，米尔贝霉素A3/A4产量相对最佳；而将BC04内源性atrAsbh敲除，胞外米尔贝霉素含量大幅上升。通过对BC04、aveI过表达菌株和atrAsbh敲除株的转录组数据进行比较分析，并结合高通量遗传学筛选鉴定了多个影响前体供给（脂肪酸β-氧化和分支链氨基酸降解，丙酰辅酶A羧化）的反应步骤和代谢途径，以及能够外排米尔贝霉素的外排泵系统，揭示了链霉菌多效调控子AtrA从前体供给和产物外排角度调控米尔贝霉素生物合成的机制。此外，在本项目执行过程中，从组学数据中AtrA显著影响的调控基因类型靶点中，还鉴定了两个新颖的调控系统（蛋白）SbrH1-R和SspH。AtrA负调控这两个系统的表达；这两个调控系统则都分别负调控了米尔贝霉素的生物合成。SbrH1-R显著影响了米尔贝霉素生物合成基因、一系列与米尔贝霉素合成所需前体合成及消耗有关的反应步骤和代谢通路基因，以及米尔贝霉素外排泵基因等的表达。SspH为链霉菌基因组中广泛存在的调控因子，在不同种链霉菌中都具有调节次级代谢的功能；在冰城链霉菌中，SspH通过影响米尔贝霉素合成基因的表达而控制产素。本项目从前体供给和产物外排角度探究了AtrA调控米尔贝霉素合成的机制，同时还从AtrA扰动的转录调控网络中鉴定新颖调控系统和高产有效靶点，为米尔贝霉素高产菌构建提供更多选择方法和奠定坚实理论基础。