冰城链霉菌生物合成米尔贝霉素（Milbemycins）基因簇克隆及基因功能分析

冰城链霉菌是课题组筛选的产生物农药米尔贝霉素A3、A4和10个新化合物的新菌株。为揭示冰城链霉菌生物合成米尔贝霉素机理，构建冰城链霉菌基因组Fosmid文库，根据已从冰城链霉菌克隆出的聚酮合成酶I类（PKSI）基因簇中的酰基转移酶（AT，GeneBank登录号FJ481148）、酮基合成酶（KS，FJ481147）、C5-O-甲基转移酶（aveD、FJ531497）、C5酮基还原酶（aveF、FJ560599）的基因序列，设计引物，通过菌落PCR从文库筛选阳性克隆，亚克隆、测序并进行DNA全长序列组装和生物信息学分析，绘制出冰城链霉菌生物合成米尔贝霉素基因簇连锁图；利用已建立的高效遗传操作体系，通过体内基因(aveD、aveF、可能影响生物合成米尔贝霉素β及基因簇中的调控基因等)敲除与回补、体外蛋白质表达与酶促分析、产物分离与结构解析，阐明基因功能和合成途径。为获得优良工程菌株奠定基础。

完成了项目的预期研究计划和目标。. 完成了冰城链霉菌（Streptomyces bingchengensis）全基因组测序(J. Bacteriol., 2010 (17):4526-7)，分析了米尔贝霉素生物合成途径。通过基因敲除与回补、体外蛋白质表达与酶促分析、产物结构解析，阐明了C5-O-甲基转移酶（C5-O-methyl transferase，aveD）C5-酮基还原酶(C5-ketoreductase，aveF。Biotechnol. Lett., 2010, 32:1497-1502)和负调控nsdA基因(J. Antibiot., 2009, 62(6):309-13)、聚醚类化合物南昌霉素生物合成起始模块基因的功能，且构建了不产杂质5-甲氧基米尔贝霉素类和南昌霉素菌株，发酵单位产量达到2300±74mg/ml，比初始菌株的27±12mg/ml提高85倍。在不产杂质5-甲氧基米尔贝霉素类和南昌霉素菌株基础上，构建了产5-酮基米尔贝霉素，以及利用转座技术获得了13羟基米尔贝霉素，这些研究获得的菌株为合成化合物米尔贝肟和乐平霉素提供中间体原料奠定了基础。. 项目发表SCI论文4篇，获得国家发明专利4项，获得黑龙江省科技发明一等奖1项。