基于ALASE过表达及敲减动物模型的急性卟啉病病理机制的研究

卟啉病是因血红素合成途径中的酶缺陷或活性改变而引发的一组疾病，尤其以急性卟啉病的危害最大，但迄今为止对急性卟啉病的病理机制仍知之甚少，主要原因是缺少合适的动物模型。申请人自主研发的ALASE(erythroid-specific ALAS)过表达转基因小鼠充分模拟了急性卟啉病的临床特征，支持了急性卟啉病的"ALA中毒学说"，是研究ALA(δ-氨基-r- 酮戊酸)的毒性作用致急性卟啉病病理机制的理想动物模型。并且，根据该模型申请人首次提出了"ALAS(ALA合成酶)活性增高可导致卟啉病"的假设。在本项目中申请人拟通过建立ALASE过表达的敲减小鼠，对该假设进行验证，并从整体水平系统、深入地研究ALA的毒性作用在急性卟啉病中的作用靶点和损伤机制，为急性卟啉病的预防和治疗提供科学依据。

卟啉病是因血红素合成途径中的酶缺陷或活性改变而引发的一组疾病，尤其以急性卟啉病的危害最大，但迄今为止急性卟啉病的发病机制不清。目前的现状是，虽然我们对卟啉病的酶缺陷和生化特征已经比较清晰，卟啉病神经症状的病因还不清楚。已知，除ALAS外，其他7个酶编码基因的缺失突变同时导致了两个结果，一个是卟啉前体过量累积，一个是血红素缺乏。由此形成了两个假说：卟啉前体毒性学说认为是ALA、PBG类具有神经毒性的卟啉前体物质导致了急性卟啉病的神经症状；而血红素缺乏学说则认为是由于血红素缺乏导致的能量缺失造成这一结果。目前已经根据卟啉病患者的突变基因建立了一些动物模型，如PBGD和PPOX敲除小鼠，但是由于卟啉前体堆积和血红素缺乏这两种因素并存于病人和动物模型体内，因而很难排除一种，证明另一种因素。因此，到目前为止仍无法在体内证明这两个学说中的任何一个。已知，体内存在两种ALAS的编码基因，同工酶ALASN和ALASE。急性卟啉病发作是ALASN被诱导表达而导致的，但是，体内ALASN受到HEME多方面的负反馈抑制，因此过表达ALASN会被随后合成的HEME抑制。为了避开HEME对ALASN的负反馈调节我们采用过表达ALASN的同工酶ALASE的策略，建立了ALASE泛表达的转基因小鼠。ALASE转基因小鼠避开了血红素的负反馈抑制，在体内呈现为ALAS酶活性持续增高的状态。结果，经病理、生化、临床检验ALASE转基因小鼠产生了明显的卟啉病神经病。值得注意的是，ALASE转基因小鼠体内卟啉物质生成过量，同时，机体内HEME水平并未降低。这证明了小鼠可以不依赖于HEME缺乏发生急性卟啉病，从而支持了卟啉前体毒性学说。为了反向验证这一结论，我们又建立了ALASE敲减小鼠siRNA-ALASE小鼠模型，通过与ALASE过表达小鼠杂交获得双转基因小鼠——拯救鼠，将ALASE小鼠体内的ALAS活性部分降低。经验证，这有效逆转了小鼠的急性卟啉病症状。从而，从正反两方面支持了急性卟啉病神经病的“卟啉毒性学说”。利用该模型我们发现肌肉和神经是急性卟啉病攻击的主要靶器官，发现ALA对神经纤丝蛋白NFP的损伤是急性卟啉病中神经损伤的重要机制之一，ALA对线粒体的损伤是急性卟啉病肌肉损伤的重要机制。通过本项目的研究，为急性卟啉病提供了一种理想的疾病模型，为急性卟啉病的发病机制提供了新的证据和线索。