INSR基因诱导性敲减II型糖尿病模型兔的建立及病理分析

本研究的目的是利用家兔转基因克隆技术平台和shRNA载体构建技术，制作可诱导性表达INSR基因shRNA干扰片段的Ⅱ型糖尿病模型兔。首先构建含有四环素操纵子的H1启动子和四环素操纵子结合蛋白TETR的表达质粒，导入neo基因作为体外筛选标记，然后把针对胰岛素受体基因INSR的shRNA的片段连接到H1启动子下游。干扰质粒经转染成纤维细胞获得转基因细胞系。通过核移植技术获得INSR基因shRNA干扰的克隆兔，并繁殖形成群体。在饲料中添加Doxycycline的情况下，降低转基因家兔INSR基因mRNA的丰度和翻译水平，导致由于INSR表达过低引起胰岛素抵抗，引发Ⅱ型糖尿病。本研究的结果将为研究Ⅱ型糖尿病的致病机理和治疗糖尿病导致的动脉粥样硬化等心血管疾病和眼科疾病提供可靠的可诱导的疾病模型。

家兔糖尿病模型对于研究Ⅱ型糖尿病病理机制以及糖尿病并发的高脂血症、动脉粥样硬化、视网膜病变的病理和治疗药物有较高的应用价值。我们通过分子设计，构建了可以由Dox诱导表达的RNA干扰载体，该载体含有shRNA表达框、四环素操纵子结合蛋白表达载体。.根据INSR基因的转录本，通过两种不同的方式设计10对Sh-RNA，通过退火和酶切连接制作不同干扰载体。通过体外转染成纤维细胞，在抗性筛选后转基因细胞系克隆。经荧光分析和PCR鉴定获得不同干扰片段的转基因成纤维细胞克隆。以不同的转基因成纤维细胞进行核移植和胚胎移植获得INSR-shRNA转基因克隆兔。INSR-RNAi转基因克隆成纤维细胞能够支持克隆胚胎发育至囊胚阶段，经过进一步的胚胎移植，可以获得发育到期的克隆兔，部分克隆兔可以存活至成年。目前已经获得6只存活的INSR-RNAi克隆兔。对其中的一只进行Doxycycline诱导实验发现，INSR-RNAi转基因兔在注射Dox后可以出现高血糖症状。. 利用不同的转基因克隆兔进行繁殖，四只克隆兔分别获得了后代。通过对不同组的后代进行Doxycycline诱导测试，来源于同一干扰载体的不同克隆兔的后代表现并不相同。我们选择了I4-2的后代进行繁殖扩群。通过对I4-2的后代进行了Doxycycline诱导高血糖的测试，发现I4-2的转基因兔后代在饮水中添加500mg/L的Doxycycline和3%的蔗糖的条件下4天以后可以出现高血糖症状（>18mmol/L）。对诱导高血糖的转基因兔的同时进行糖耐量实验发现I4-2的阳性后代糖耐量和阴性后代无明显差异，在禁食的情况下后期会出现低血糖。糖尿病兔同时出现了高胰岛素血症。RT-PCR显示Dox存在的情况下INSR的表达量显著降低，相关糖代谢通路被阻断。. 研究证明，稳定整合INSR-shRNA表达质粒的转基因细胞可以支持整个胎儿发育，新生转基因克隆兔可以健康生长至成年。验证了课题设计的可行性。通过转基因克隆兔及其后代的doxycycline诱导实验显示，在dox的作用下家兔的血糖明显上升，达到了糖尿病模型指标。该模型兔群体将为Ⅱ型糖尿病病理机制以及糖尿病并发的高脂血症、动脉粥样硬化、视网膜病变的病理和治疗药物的研究提供基础。