四个lncRNA分子介导的DNA损伤通路对多发性骨髓瘤调控机制的研究及意义

Long non-coding RNAs (lncRNAs) are emerging as an important class of regulatory transcripts that are implicated in a variety of biological functions in turmor, which has become the area of concern in ncRNA field. However, there is still unknown the mechanism of lncRNA in multiple myeloma (MM). Our previous work has been identified the lncRNA expression pattern and found the distinct four lncRNAs,including GAS5, CRNDE, lncRNA LOC400657, and PMS2P3, which could effect the prognosis and are highly susceptible to mediate DNA damage pathway (Du J et al. the 14th International Myeloma Workshop, IMW2013, Abstract No.147. April 2013, Tokyo, Japan). Therefore, we intend to explore deep regulation function mechanism of the four important lncRNAs mediated DNA damage pathway in vitro and in vivo. To explore the regulation model of lncRNA target Chk1, Chk2 genes in DNA damage pathway, to identify the rgulation model between lncRNA and Chk1, Chk2 by RIP, RPA, immuno-electron microscope assays, and to demonstrate the role of 4 lncRNAs in MM development. This study will demonstrate the molecular mechanism and thus lay the foundation for further research and explore promising treatment regimens.

长链非编码RNA(lncRNA)是表观遗传学最值得关注的领域，与肿瘤发生发展的关系日益凸显,但lncRNA对多发性骨髓瘤（MM）的调控机制，仍无报道。我们借助生物信息学方法已筛选MM差异lncRNA表达谱，发现4个lncRNA分子GAS5、CRNDE、lncRNA LOC400657、PMS2P3可作为独立因素与MM不良预后相关,并可能介导DNA损伤通路上的Chk1、Chk2分子发挥功能（将在国际会议交流）。因此，本研究将以影响预后的4个lncRNA分子介导的DNA损伤通路为切入点，通过体内、体外实验探索其是否通过靶向Chk1/Chk2分子发挥调控功能，并借助RNA免疫沉淀，RNA 酶保护实验，免疫电镜等方法确认lncRNA与靶向Chk1、Chk2分子的调控模式，阐明4个lncRNA参与MM的发生、发展，以及能否为治疗提供靶点,从而为丰富理论认识和指导临床实践开拓新的领域和空间。

近十年来多发性骨髓瘤（MM）发病机制和治疗策略的研究均具有重大突破，几乎所有患者最终复发、耐药而不治。继microRNA后在非编码RNA领域的又一研究前沿——长链非编码RNA（lncRNA)，已明确参与肿瘤的发生、发展 ，但对MM是否也起重要调控机制目前尚无认识。本课题重点围绕lncRNA分子，首先在大规模MM临床样本中检测了四个lncRNA分子GAS5, CRNDE, lncRNA LOC400657和PMS2P3的表达，并且验证出GAS5和CRNDE其对预后的影响。而后从细胞水平分别检测对细胞的增殖和凋亡的影响，发现GAS5和CRNDE可影响MM细胞的凋亡和增殖。综合以上结果，在预期的四个lncRNA分子中GAS5和CRNDE无论对临床预后及MM细胞水平均有影响，然而lncRNA LOC400657和PMS2P3均未观察到临床生物学意义，并且后面两个lncRNA分子目前仍无文献报道。从研究的意义角度考虑，对临床预后具有重要指导价值的lncRNA分子，才具有潜在的作为临床预后分子生物学标记的潜能，也许lncRNA LOC400657和PMS2P3尚不具备生物学功能。因此在接下来的生物学功能研究中，集中lncRNA分子中GAS5和CRNDE进行研究。在通路预测惊奇的发现GAS5和CRNDE可以共同靶向mTOR通路上的下游靶基因为eIF4家族基因eIF4A3基因。本课题组前期多年重点围绕mTOR信号通路不断探索和研究，本课题也发现研究靶点可以共同靶向mTOR通路下游靶点，并且mTOR通路在MM细胞的发生、发展和调控机制中发挥重要功能，若能集中对mTOR通路深入研究，不仅能保证研究的可靠和保真性，更深化了本课题组的研究特色和方向。因此在后序功能试验中，集中对GAS5和CRNDE可能靶向的mTOR通路进行研究。首先验证了GAS5和CRNDE与eIF4A3的靶向关系，进而观察到分别下调GAS5和CRNDE的表达影响mTOR通路eIF4A3和S6K的磷酸化水平。在药敏、集落形成实验及动物实验中，也进一步验证GAS5和CRNDE的生物学功能。综上所述，我们围绕骨髓瘤细胞的lncRNA按照从“网”到“面”到到“应用”的系统生物学研究思路，对其机制和潜在药物靶点进行了整体性分析，在认识骨髓瘤细胞及非编码RNA等关键科学问题上提出了新的发现，对临床具有重要的指导价值。