多发性骨髓瘤侧群细胞相关microRNA筛选及鉴定

具有干细胞特性的侧群细胞(SP细胞)的发现，为缺乏特异性表面标记的骨髓瘤干细胞的研究提供了全新思路。然而，对正常和肿瘤干细胞具有重要调控作用的microRNA（miRNA）分子，在骨髓瘤SP细胞的研究仍为空白。本课题拟在成功分离、鉴定骨髓瘤SP细胞的基础上，采用包含预测位点的miRNA芯片技术，筛选骨髓瘤SP细胞相关miRNA表达谱，并采用Northern blot和Real-time RT-PCR技术对新发现的miRNA分子进行结构鉴定；通过生物学信息技术，预测处于与干细胞发育、分化密切相关的Hedgehog信号传导途径的相关靶基因，结合RNAi技术探索miRNA分子对靶基因的功能影响及对骨髓瘤SP细胞增殖、凋亡、细胞周期、化疗药物敏感性的作用，以期发现骨髓瘤SP细胞新的miRNA分子，并阐述其分子机制，为后续深入的miRNA分子在骨髓瘤SP细胞的体内功能研究和开拓治疗新策略奠定基础。

具有干细胞特性的侧群细胞(Side population,SP)的发现，为缺乏特异性表面标记的多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM)干细胞的研究提供了全新思路。然而，对正常和肿瘤干细胞具有重要调控作用的microRNA（miRNA）分子，在骨髓瘤SP 细胞的研究仍为空白。本课题首先成功分选了MM细胞株和原代标本的SP细胞，含量波动于0.8256～1.762%和0.04～2.0%，进而鉴定了SP细胞肿瘤干细胞特性。发现95.47%的NCI-H929 SP细胞处于G0/Gl 期，较少的处于S期；集落形成数SP明显高于MP细胞(1392±257 VS 550±15，P=0.08)， ABCG2的表达SP细胞明显高于MP细胞（P<0.05），然而免疫表型无差异。而后发现三氧化二砷（AS2O3）可特异性作用SP细胞；其余抗骨髓瘤药物(硼替佐米、雷那度胺、表阿霉素、地塞米松)未观察到对SP细胞的影响。由于AS2O3可以作用SP细胞，拓展研究了AS2O3对MM细胞组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的作用，发现As2O3可增加HDAC6胞浆底物－微管蛋白和HSP90乙酰化水平，抑制HSP90伴侣分子的功能，影响NF-KB信号通路。在SP细胞相关特异miRNA表达谱的筛选发现43个特异性miRNAs分子（包括12个显著上调和31个下调miRNAs 分子）, miRNA-451、miRNA-144和miRNA-150经qRT-PCR验证。生物信息学预测出多个重要信号通路与SP细胞相关，包括对实体瘤干细胞影响的mTOR通路及对MM具有重要生物学功能的NF-KB通路，同时也扩展研究了NF-KB信号通路相关基因的基因型改变对接受新药治疗的骨髓瘤患者疗效和预后的影响。而后阐明了特异的miRNA-144分子对骨髓瘤细胞生物学功能的影响；而后对可调控mTOR信号通路CAB39基因的miRNA-451生物学功能的研究，发现抑制miRNA-451的表达可增加药物的抗骨髓瘤作用。使用特异性mTOR信号通路抑制剂可阻断NCI-H929的SP细胞表达。这些研究结果为开发以miRNA作为分子靶点的抗骨髓瘤药物具有潜在的社会应用及经济价值。本课题已发表两篇SCI文章（累计影响因子 10.516分），获得3个奖项，在2012年的第54届美国血液年会口头发言，三次受邀大会报告，并培养三名研究生。