FAM122A调控DNA损伤反应的分子机制及其意义

The signaling mechanism of DNA damage response is always one of the most important topics in medical research. We previously found that FAM122A is the substrate of F-box family proteins by the application of proteomics technology. However, the function of FAM122A protein is still little known. Recently, we found that the suppression or overexpression of FAM122A protein significantly enhanced or decreased the sensitivity of etoposide-induced DNA damage response. Further studies showed that FAM122A interacted with several molecules involved in the signaling of DNA damage response. Moreover, FAM122A proteins from the mitotic cells existed a phosphorylation form, the latter might promote the degradation of the protein itself. These preliminary data strongly suggested that FAM122A could modulate DNA damage response. Based on these findings, we will confirm the in vivo effect of FAM122A on the regulation of DNA damage response, and deeply elucidate the molecular mechanism of FAM122A-regulating DNA damage response and its biological significance through the identification of interacting proteins with FAM122A. This will not only reveal that FAM122A has a role in DNA damage response, but also possibly shed new insights for understanding the regulation network of DNA damage response.

DNA损伤反应信号调控机制一直是医学研究的重点热点之一。本课题组运用蛋白组学技术发现FAM122A蛋白属于F-box家族蛋白的底物。然而，关于FAM122A蛋白的功能研究几乎缺乏。新近，我们发现FAM122A的抑制表达或高表达显著增强或抵抗细胞对DNA损伤诱导剂Etoposide的敏感性，进一步发现FAM122A和参与DNA损伤反应信号通路中的多个分子之间存在相互作用，并且FAM122A蛋白在分裂期细胞中存在磷酸化修饰，后者可能促进该蛋白的降解。这些初步结果强烈提示FAM122A参与调控DNA损伤反应。本课题将以这些重要发现为基础，进一步确认FAM122A调控DNA损伤反应的体内效应；通过识别FAM122A相互作用蛋白，深入阐明FAM122A调控DNA损伤反应的分子机制及其生物学意义。本课题的实施可望揭示FAM122A在DNA损伤性反应中的作用，对于认识DNA损伤反应调控网络具有重要意义。

课题组通过系列研究发现，FAM122A是PP2A的内源性抑制剂，FAM122A直接与PP2A-Aalpha和PP2A-B55发生相互作用，从而抑制PP2A-Aalpha/B55/Calpha的磷酸酶活性，同时发现FAM122A的表达增强PP2A-Calpha蛋白的泛素化，并促进其降解（相关结果已发表）。文献提示，PP2A亚基分子的异常调变在肝癌发生发展中发挥作用。为此，我们在肝癌细胞系SMMC-7721中利用Cas-9系统构建了FAM122A敲除的细胞系（KO-1和KO-2）和相应的NC细胞，发现FAM122A缺失后，对短期的细胞生长并无明显的影响，但是平板克隆以及软琼脂实验发现（图1-图2），FAM122A缺失后可明显抑制细胞的克隆形成能力。同时发现，FAM122A缺失能有效地增强DOX诱导的HCC细胞的凋亡敏感性。之后将通过裸鼠体内成瘤实验，明确FAM122A的调变对于HCC细胞在动物体内的成瘤作用。在此基础上，进一步探讨其发生机制。同时也将在肝脏中特异性敲除FAM122A，经传统的肝癌造模方式，观察在FAM122A有或无的基础上，对HCC的发生发展是否存在影响，以及对于化疗药物的敏感性是否存在差异。. 另一方面，FAM122A基因缺失可导致小鼠胚胎致死，死亡发生在E9.5-10.5（图3），同时经解剖直视显微镜和CD31抗体染色发现，FAM122A缺失的胚胎卵黄囊表面大血管形成障碍，但是仍能形成微血管，高倍镜观察发现，与野生型微血管比较，FAM122A缺失的微血管中，血管内皮细胞间排列明显松弛（图4），提示血管内皮排列或分布异常可能是导致大血管生成障碍的原因。为了探讨FAM122A缺失导致大血管形成障碍的机制，将分离获得的E9.5 FAM122A野生型与缺失的卵黄囊组织送检RNA-seq和蛋白差异条带的LAB free分级，分析发现，在基因和蛋白水平均有调变的候选分子有63个，之后将进一步筛选与血管形成相关的分子进行后续的机制研究。另一方面，通过分离获得原代的HUVEC细胞，发现FAM122A敲低能够明显抑制网络状管样结构的形成，目前正在尝试做3D tuber formation。之后将进一步构建血管内皮细胞中特异性敲除FAM122A小鼠模型，验证FAM122A对于血管形成的影响。以上工作将为阐明FAM122A的功能奠定基础。