NP磷酸化对A型流感病毒复制的调控机理

Phosphorylation of viral proteins plays important roles in the influenza A virus life cycle. Many phosphorylation residues of nucleoprotein (NP) have been reported. However, the functions of these phosphorylated sites have not been elucidated systematically. In our previous study, nine phosphorylated residues on the NP of influenza virus had been identified by mass spectrometry. In the present proposal, the effect of NP phosphorylation on the replication of influenza A virus will be further investigated. We will introduce alanine or glutamic acid substitutions at these sites and examined their effects on virus growth by using the reverse genetic system and plaque assay. Then we will focus on the effect of NP phosphorylation on the cellular localization of NP, the viral polymerase activity, and its interactions with the components of viral ribonucleoprotein complex and RNA. The study will provide novel targets for the development of novel anti-influenza drugs.

磷酸化是蛋白翻译后的一种重要修饰手段，A型流感病毒某些蛋白的磷酸化在流感病毒的复制过程中发挥着重要作用。A型流感病毒核蛋白NP（nucleoprotein）上的若干磷酸化位点已被报道，然而大多数磷酸化位点的功能仍然未知。我们的前期研究利用PAGE方法富集磷酸化的NP，通过飞行质谱鉴定得到9个新的NP磷酸化位点。本项目拟研究NP磷酸化对流感病毒复制的影响及其作用机理。首先将NP的磷酸化位点替换为模拟持续磷酸化的谷氨酸或去磷酸化状态的丙氨酸，利用反向遗传系统拯救突变病毒，检测病毒滴度及病毒多步生长曲线，筛选能够影响病毒复制的NP磷酸化位点。然后利用IFA/IP/WB等技术手段检测磷酸化是否影响NP的出核/入核，是否改变NP与病毒核糖核蛋白复合物vRNP中各组分或病毒RNA的结合从而影响病毒的聚合酶活性，进一步阐明NP磷酸化对A型流感病毒复制的调控机理。本研究将为抗流感药物的研发提供新的靶点。

磷酸化是真核细胞蛋白的一种翻译后修饰加工手段，能够调控蛋白的多种功能。流感病毒基因组RNA的复制和转录是由核糖核蛋白复合物（vRNP）完成的，核蛋白NP是其重要的骨架蛋白，对于流感病毒生长和病毒基因组的复制与转录都发挥着重要的作用。在病毒的复制周期中，vRNP复合物会经历核质穿梭的过程，在其中NP蛋白扮演着重要角色。本研究阐明了NP蛋白S9、Y10和Y296对于病毒复制和病毒拯救的调节机制。发现将这3个位点进行模拟磷酸化突变和去磷酸化突变后，会分别造成病毒无法利用反向遗传包装系统成功拯救和在细胞水平上和动物感染模型中的复制效率显著下降，并进一步的研究发现S9和Y10的磷酸化能够抑制NP蛋白的入核行为，分析其原因是由于破坏了NP蛋白与细胞核的运输蛋白受体importin-α蛋白的相互作用导致的；而Y296的磷酸化则减弱了NP蛋白的出核，其原因是磷酸化使NP蛋白同胞浆的运输蛋白载体CRM1蛋白的结合丧失。最后，鉴定发现在病毒感染早期NP蛋白位于细胞核内时，Y10位点处于未被磷酸化的状态，而Y296则被磷酸化修饰；在病毒感染后期NP蛋白处于细胞质内时，Y10位点被磷酸化修饰，而Y296则被去磷酸化。结合其上，我们发现S9、Y10和Y296的磷酸化与去磷酸化能够调控病毒复制过程中NP蛋白的核质穿梭过程。此外，我们利用质谱技术鉴定得到了NP蛋白上的7个未报道的磷酸化位点，并发现在这些位点中，Y385位点的磷酸化和去磷酸化能够调控流感病毒的复制和病毒RNA聚合酶的活性，进一步研究其机理发现Y385位点的磷酸化能够使NP蛋白从多聚体形式转变为单体形式，从而减弱了NP同RNA的结合力；而其去磷酸化形式则能够回复这种改变。这些结果表明了NP蛋白的磷酸化在病毒复制周期和NP蛋白本身功能发挥中的重要作用，同时也为抗流感药物的研发提供了新的靶点。