PKR调节脂毒性胰岛β细胞整体功能障碍机制研究

诱导宿主细胞增殖抑制和凋亡是胞内模式识别受体PKR抵抗病毒感染的重要机制。在营养代谢调节中，PKR也能被高糖高脂激活，而其是否分享与病原免疫相似的调节机制及生物学功能并不清楚。本项目拟采用脂毒性模型，阐明脂酸激活的PKR在诱导胰岛β细胞周期阻滞和凋亡，减少β细胞数量，降低机体胰岛素整体水平的调控机制。PKR的激活及其生物学功能受其结合结构的调节，采用免疫共沉淀结合双向电泳技术筛选与PKR的RBM和TRAF结合模体直接作用的信号分子，并运用干扰RNA技术鉴定各结合信号分子与PKR上下游关系；通过构建PKR失活突变体和截短体，研究PKR作为衔接蛋白及其结合结构发挥的生物学功能，以揭示其在脂毒性中的特异分子机制，最后验证PKR激酶活性抑制或衔接功能改变对体内β细胞整体功能的影响。以此探寻治疗2型糖尿病的新药物靶点，拓展对病原免疫系统参与营养代谢障碍调节的新认识。

基于病原免疫与营养代谢分享相似调节机制及生物学功能的认识，本项目采用糖脂毒性及炎症因子刺激模型，研究了免疫分子PKR对营养代谢中心组织胰岛β细胞整体代偿功能的影响，揭示了PKR激酶活性和蛋白结合功能调控β细胞分裂增殖的分子机制。发现高糖高脂及TNF-α能显著上调胰岛β细胞PKR/eIF2α通路。激活的PKR能导致β细胞增殖能力下降，且阻滞于G1期；还能诱导cyclin D1/2蛋白水平下调和P27、P53 蛋白含量上调；蛋白酶体抑制剂能显著拮抗cyclin D1/2蛋白水平下调，表明泛素蛋白酶体系参与了PKR诱导的cyclin D1/2降解及细胞周期调控。在IGF-I诱导下，PKR的激活能抑制β细胞生长，通过G1期阻滞减弱其增殖能力，且伴随IRS1和JNK活性上调和Akt蛋白活性下调。.为了揭示PKR通过P53调控β细胞增殖的分子机制，采用基因克隆诱导PKR特异激活，发现：PKR能与SUMO E2连接酶Ubc9相互结合，诱导P53 SUMO化修饰及其蛋白水平上调。而壮观霉素B1能抑制PKR诱导的P53 SUMO化修饰及其蛋白增加。此外，反应糖脂毒性和炎症因子刺激，PKR抑制剂或神经酰胺合成酶抑制剂也能通过抑制神经酰胺积累和PKR活化，下调P53 SUMO化修饰及其蛋白活性。.除激酶活性，PKR还能作为衔接分子，通过蛋白相互结合发挥生物学功能。采用GyrB-PKR-K296H融合基因截短体体系，在β细胞中构建PKR蛋白结合功能上调模型，即在无酶活性的情况下，单因素研究PKR蛋白结合功能。发现PKR蛋白结合功能通过促进G1/S期转化来诱导β细胞增殖，这与c-Myc基因的转录上调密切相关。NFκB转录活性参与了PKR蛋白结合功能诱导的c-Myc基因表达；PKR通过募集TRAF2而不是TRAF3/6来激活下游信号分子，继而泛素化RIP1并激活NFκB转录活性，促进胰岛β细胞增殖。.因而，抑制PKR的激酶活性，而保留PKR蛋白结合功能，能促进胰岛β细胞增殖及体内β细胞整体功能。能为改善2型糖尿病的药物治疗提供新的新药物靶点，并拓展对病原免疫系统参与营养代谢障碍调节的新认识。.研究还揭示模式识别受体TLR3通过“TRIF/P38/泛素-蛋白酶体/cyclin D” 信号和Rig-I通过与Src竞争结合调控“Stat3/Skp2/ P27”通路抑制β细胞增殖的分子机制。