蛋白激酶中非磷酸化修饰形式鉴定的系统研究

蛋白激酶是介导蛋白质发生磷酸化修饰的生物催化酶，调节信号转导等重要生物功能。临床医学表明，超过50%的肿瘤与蛋白激酶的异常表达相关，激酶是当前抗肿瘤药物的热门靶点。以往的研究认为激酶的功能仅与其磷酸化修饰有关，随着激酶研究的深入，人们发现一些激酶中存在磷酸化修饰以外的其它类型修饰，并与肿瘤有密切联系。然而，通常这些非磷酸化修饰在激酶中鉴定困难，目前尚没有系统有效的分析方法。本课题以激酶中低丰度非磷酸化修饰为目标，联合标签激酶蛋白融合过表达与亲和富集技术、LC/MS/MS分析以及新的蛋白修饰专门软件PTMap，建立激酶非磷酸化修饰鉴定的新方法，系统分析80种主要酵母激酶的各种非磷酸化修饰状态，在激酶蛋白家族中搜寻新的、未知的蛋白修饰形式。最后研究检测食管癌细胞内激酶修饰变化的定量方法。本课题是对激酶修饰分析方法的发展和补充，有利于新的、未知的蛋白修饰的发现，促进激酶生物功能的研究。

本项目以激酶家族蛋白中低丰度、非磷酸化修饰为目标，联合标签激酶蛋白融合过表达与亲和富集技术、基于质谱技术的蛋白质组学方法，以及新的蛋白修饰信息学分析工具，建立了蛋白激酶非磷酸化修饰的鉴定新方法。与以往的分析策略相比，该方法能够更全面地分析激酶上各种修饰形式。我们采用这一集成方法分析了酵母细胞中80种激酶的各类蛋白修饰形式，初步研究了酵母激酶家族蛋白的非磷酸化修饰图谱。我们的研究表明：激酶中可能存在很多未见报道、磷酸化以外的蛋白修饰形式，一些修饰的结构尚不清楚。通过对色氨酸和半胱氨酸等残基上发现的各种修饰形式的解析和分析，我们探讨了其中一些未知修饰的结构和可能的发生机理。我们专门对激酶蛋白中鉴定到的8种羟基化修饰进行了研究，大部分羟基化修饰位点都未见文献报道，我们初步探索了这些羟基化修饰的酶促反应机理和发生规律。我们尝试将发展的蛋白组学分析方法应用于食管癌标志物的研究。我们研究了与肿瘤侵袭密切相关的骨架结合蛋白Ezrine、及其修饰和蛋白复合物的分离鉴定新方法，并尝试应用于不同侵袭性食管癌细胞的表征；探索了组蛋白表观遗传修饰的分离、富集和鉴定新方法，并尝试应用于食管癌侵袭与组蛋白表观遗传修饰关联性的研究；采用集成的定量蛋白质组学技术和生物信息学方法，探索了抗肿瘤药物在食管癌中靶点作用蛋白的鉴定，以及对靶向蛋白网络的调控。. 本项目按照研究计划执行，完成既定目标。项目的部分研究成果已经发表SCI论文8篇，核心论文1篇，另有2篇论文已被SCI杂志录用。