蛋白激酶A（PKA）介导自噬基因Beclin1磷酸化修饰的功能解析

自噬近年来因其在恶性肿瘤等许多疾病中起着重要作用而受到极大关注，现已公认自噬基因Beclin1是单倍体缺失型肿瘤抑制基因。Beclin1与III型PI3K（PI3KC3）形成复合物在自噬体形成中起着关键作用。越来越多的研究表明在自噬调节的复杂网络中PKA信号参与自噬的调节，但其具体分子作用机制不清。我们前期研究成果表明PKA可以直接在S295位点磷酸化Beclin1，该位点位于与PI3KC3相互作用结构域内，揭示PKA信号网络可能通过Beclin1磷酸化调节PI3KC3的活性从而对自噬进行调控。本项目拟在前期工作基础上，解析S295位点磷酸化对Beclin1与PI3KC3相互作用及PI3KC3脂质激酶活性的影响；阐明Beclin1磷酸化在PKA信号调控自噬作用中的意义。本项目将加深我们对Beclin1上游调控信号以及PKA信号调控自噬分子机制的理解，对于寻找新的药物靶点具有非常积极的意义。

项目的背景：PKA信号通路的活化抑制细胞自噬的发生，但PKA如何抑制自噬，其机制不清楚。本项目旨在解析PKA是否通过磷酸化Beclin1而参与自噬的调控作用。.主要研究内容：.（1）.明确Beclin1的S295位点磷酸化对自噬的影响.（2）.明确Beclin1的PKA介导的S295磷酸化对其在细胞内分布的影响.（3）.明确Beclin1的PKA介导的S295磷酸化对其与PI3KC3相互作用的影响.（4）.明确Beclin1的PKA介导的S295磷酸化对PI3KC3脂质激酶活性的影响.（5）.明确Beclin1的S295磷酸化在PKA信号调控自噬活性中的作用.研究结果：本项目通过双向电泳、质谱分析鉴定出PKA直接磷酸化Beclin1。通过生物信息学分析，S295为PKA潜在磷酸化位点，采用定点诱变和体外磷酸化，确定了PKA在S295位点磷酸化Beclin1。本项目通过构建模拟S295磷酸化（S295D）和阻碍S295磷酸化（S295A）突变型Beclin1表达载体，解析了S295磷酸化对Beclin1的细胞内定位及细胞自噬的影响。本项目发现S295磷酸化状态对Beclin1的细胞内定位无明显影响。S295A Beclin1与PI3KC3的基础结合水平增加，饥饿增加Beclin1与PI2KC3的相互作用，但与是否磷酸化没有关系。我们还发现S295A Beclin1增加基础水平的PI3KC3脂质激酶活性及细胞自噬，但在饥饿诱导的自噬时，S295A Beclin1失去促进作用。另外，我们还发现forskolin抑制野生型Beclin1诱导的自噬，而对S295A Beclin1诱导的自噬无抑制作用。本项目表明PKA可能通过该磷酸化Beclin1而抑制自噬。.科学意义：本项目首次阐明Beclin1是PKA的直接磷酸化底物，PKA通过磷酸化Beclin1抑制PI3KC3的脂质激酶活性及自噬。本项目有助于我们理解PKA抑制自噬的分子机制。