丝/苏氨酸蛋白激酶TBK1的磷酸化修饰及上游激酶的发现和分子调节机制研究

Type I interferon (e.g. IFNα/β) produced during innate immune response plays crucial roles in anti-viral response. During the process of recognition of pathogen-associated molecules patterns (PAMP) by pattern recognition receptor (PRR) of innate immune system and the subsequent activation of IFNα/β production, the serine/threonine kinase TANK-binding kinase (TBK1)-mediated phosphorylation and activation of interferon regulatory factor (IRF)3 and IRF7 locates at the center of the signaling machineries. Previous studies have suggested that phosphorylation of TBK1 is crucial for its kinase activity. However, the key serine/threonine/tyrosine residues modified during innate response and especially the upstream kinases mediating phosphorylation of TBK1 have not been clearly elucidated. We aim to identify the key residues in TBK1 modified by phosphorylation after virus infection, investigate the effects of these phosphorylated residues on the kinase activity of TBK1, the production of IFNα/β and the anti-viral signaling pathways, and explore the upstream kinases that can phosphorylate TBK1 and thus promote the kinase activity of TBK1. Our study may identify the key kinases upstream TBK1, improve the understanding of molecular mechanisms regulating IFNα/β production, and possibly provide new targets for the treatment of diseases (e.g. viral infection, tumor and systemic lupus erythematosus) associated with IFNα/β and TBK1.

I型干扰素（如IFNα/β）是天然免疫过程中发挥抗病毒效应的关键细胞因子。在天然免疫系统通过模式识别受体识别病原体的病原相关的分子模式，诱导I型干扰素产生的过程中，丝/苏氨酸蛋白激酶TBK1介导的干扰素调节因子（IRF）3/7的磷酸化和活化是其核心机制。TBK1的磷酸化修饰对其激酶活性有很重要的调节作用，但是TBK1的关键磷酸化修饰位点及其上游的蛋白激酶仍然没有完全阐明。因此我们将应用蛋白质谱的方法鉴定病毒感染后TBK1中发生磷酸化修饰的关键氨基酸位点（丝/苏/酪氨酸），明确这些磷酸化位点的修饰对于TBK1的激酶活性及其对抗病毒信号通路和IFNα/β产生的影响；重点探讨能够磷酸化修饰并促进TBK1激酶活性的上游激酶及其效应和机制。我们的研究将发现关键的TBK1相关激酶，丰富IFNα/β的分子调节机制，为TBK1和IFNα/β相关疾病（如病毒感染、肿瘤、SLE等）的治疗提供潜在靶标。

模式识别受体（PRR）识别病原体相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP），触发下游信号传导，在感染与炎症性疾病过程中发挥重要作用。天然免疫应答的分子调控机制以及其与免疫性疾病的关系需要更深入的研究。TBK1和其同源物IKKε通过磷酸化底物蛋白IRF3和IRF7调控I型干扰素的产生和抗病毒天然免疫应答，在多种PRR信号通路中处于核心的地位。但是，TBK1的活性调控机制尚不完全清楚。因此，我们假设TBK1的活性可能受到上游激酶的调控，影响抗病毒天然免疫。我们的研究发现TBK1在受到病毒刺激后，发生广泛的磷酸化，其中包括Tyr179和Ser93两个磷酸化修饰位点。TBK1的Tyr179和Ser93分别点突变后的突变体不能够在Tbk1-/-的RAW264.7细胞中恢复TBK1缺失导致的IFNβ产生障碍。进一步利用TBK1的免疫共沉淀结合蛋白质谱分析，我们发现TBK1蛋白激酶复合体中有酪氨酸激酶Src和丝苏氨酸蛋白激酶TAOK3。Src激酶抑制剂或者Src基因敲除可以显著抑制TBK1酪氨酸磷酸化和Ser172的自身磷酸化，导致RAW264.7细胞I型干扰素产生下降以及病毒清除能力的下降。同时，在Taok3-/-小鼠中，针对RNA病毒VSV和DNA病毒HSV-1的抗病毒天然免疫应答显著异常。在Taok3-/-巨噬细胞中，病毒感染后TBK1-IRF3的磷酸化和活化以及I型干扰素的产生显著下降。我们的研究提示在抗病毒天然免疫应答中，TBK1受到Src和TAOK3的磷酸化修饰，Src和TAOK3都参与TBK1-IRF3信号通路的活化。我们的研究为PRR诱导的抗病毒天然免疫的分子调控机制提供了新的认识。