转基因体细胞克隆牛妊娠维持相关MicroRNA的筛选及鉴定

Transgenic and cloned technology has been successfully obtained a variety of cloned animals, but the efficiency is very low in mammalian cloning. Most cloned animals were aborted during pregnancy, only a few are able to develop to the end of pregnancy or adult. In this study we will collecte a number of aborted transgenic bovine foetus (hypophysis), placenta, and luteal, which are derive from the gestation period 155~243 day duuring the pregnancy. And the normal fetus (hypophysis), placenta, and luteal samples derived from the same gestation period will use as controls. After miRNA sequencing, we will find the important genes and miRNA which regulated the pregnancy by GO and KEGG Pathway analysising.We will attempt to establish gene regulatory networks related to maintain pregnancy during the bovine pregnancy.

利用转基因克隆技术已经成功获得了多种动物，但效率非常低。主要是大多数克隆动物妊娠维持失败，只有少数能发育到妊娠末期或成年。本研究拟收集妊娠155~ 243天期间流产的转基因牛胎儿（垂体）、胎盘和母体黄体样品（各6头）为研究材料，同时采集常规体内胚胎移植后妊娠155~ 243天的胎儿（垂体）、胎盘和母体黄体(各6头)样品设置为对照，拟通过miRNAs测序，然后进行GO、KEGG Pathway显著性富集分析寻找调控妊娠维持相关的重要基因和miRNAs，试图建立转基因克隆牛妊娠过程中妊娠维持相关基因间的调控网络，进一步研究其调控机理。

转基因克隆动物发育障碍相关研究表明，除不完全重编程造成的胚体发育异常外，胚外组织（胎盘）以及母体妊娠维持相关机制（相关激素分泌及妊娠黄体功能）也是晚期妊娠维持失败的原因。在本研究中，我们首先比较分析了正常妊娠牛、转基因克隆正常分娩牛和转基因克隆晚期妊娠失败牛母体的FSH、LH、E2、P激素的变化水平。然后采集了体内胚移植晚期妊娠（180-210d）正常（Normal group，NG）和转基因克隆晚期妊娠异常（Abnormal group，AG）个体的母体黄体、胎盘和胎儿垂体组织。提取Total RNA后进行了RNA测序分析，分别检测了胎盘和垂体组织中miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA的表达谱以及母体黄体组织的miRNA表达谱，并针对差异表达RNA进行了GO和KEGG分析以阐述其与表型的关系。结果发现，两组之间的RNA表达谱在3种组织中均不相同。研究认为胎盘转运相关基因表达异常（SLC16A4、SLC7A1、SLC16A11、GJB1等）和母体黄体miRNA表达异常（PC-3p-48446_8、hsa-miR-574-3p_R-1_1ss18CT、bta-miR-495、hsa-miR-708-3p_R+1_1ss3AT等）是转基因克隆牛晚期妊娠失败的原因之一。由于胎儿垂体bta-miR-124a异常表达，可能导致胎儿排出更多水分到尿囊中，加重了子宫异常增大现象。而黄体相关激素水平的变化也是流产原因之一。多种因素共同作用下，导致了晚期妊娠失败。本研究为转基因克隆动物晚期妊娠失败的机制研究提供了新的理论基础，为提高克隆动物的发育效率提供了新的方向。