番茄AMS基因的功能验证及其调控花药发育的分子机制解析

Although hybrid superiority technique has made remarkable contribution to the promotion of many crops yield, in current hybrid breeding applications, the deficiency of male sterility resources and the instability of male sterility trait severely confined the F1 hybrid seed production. As the deeply researches and development of genomics, transcriptomics and proteomics, it is possible to explore the molecular mechanism of anther development. Based on the cloning and sequencing of the transcription factor AMS involving in anther development, our attempt is to construct the over-expression vector, RNAi vector, gene knock-out vector(CRIS/Cas9) and tapetum specific expression vector respectively, these vectors all contain AMS. Furthermore, we are planning to transform the vectors into tomato genome using Agrobacterium-mediated system. We are attempted to identify and select the transgenic male sterility plants which would be used to the test the AMS gene function. Our researches may reveal the molecular mechanism of AMS gene in the anther development of tomato after screening differential expression genes and the involved genes under the regulation of AMS factor, using RNA-seq, proteomics quantitative analysis and ChIP assay technique..　　This investigation would be of great potential importance in the field of the tomato hybrid breeding through transgene biotechnology. It may not only set the theoretic resource foundation in creating male sterility, but also has attractive application prospect to breed the new male sterility lines.

番茄杂种优势明显，但番茄雄性不育材料在实际应用中局限较多，难以推广。加强对番茄雄性不育调控机制的研究，可望获得新的突破。随着基因组、转录组及蛋白组学的发展，从不同层次（DNA、RNA和蛋白质）上来探讨番茄花药发育调控的分子机制已成为可能。项目拟采用前期所克隆的番茄花药发育关键转录因子Aborted microspores(AMS)，分别构建超表达、干涉（RNAi）、基因敲除（CRISPR/Cas9）和绒毡层特异表达等5种表达载体，通过农杆菌介导法将载体转化番茄，获得人工创制的雄性不育突变体的同时，达到验证AMS基因功能的目的；于不同花药发育时期对转化番茄取样，进行转录组测序和蛋白组学定量，结合染色质免疫共沉淀（ChIP）和酵母双杂交技术，筛选其中差异表达和受AMS直接调控的下游基因，进一步解析AMS在整个番茄花药发育过程中的分子机制。项目可为创制番茄雄性不育研究奠定前期理论和应用材料基础。

项目以番茄花粉cDNA为模板，通过PCR克隆出番茄花药发育关键基因 AMS并进行测序分析，扩增片段大小为1806bp,该基因序列与参考基因序列相似度为100%，与潘那利番茄的相似性高达98%，与甜椒、马铃薯的同源性分别为:89%、96%。该基因编码602个氨基酸。亚细胞定位预测显示该基因位于细胞质中，其置信度为100，无规则卷曲是其蛋白二级结构的主要构成元件。. 项目分别构建AMS基因超表达载体和基因敲除载体，通过农杆菌介导法转化Ailsa Craig番茄品种，分别获得了相应的再生植株，采集野生型和转基因番茄植株花粉，通过扫描电镜观察比较不同调控模式下的转化植株花粉形态和活力，基因敲除植株的花粉活力显著低于对照花粉，活力仅为11%，对照花粉为呈椭圆形，AMS基因敲除的花粉表现为明显的圆形，菱形。超表达植株花粉活力显著低于对照花粉，活力为40%。超表达植株花粉多呈萎缩，干瘪等畸形。. AMS 编辑和超表达均会造成花粉败育，编辑处理主要在花药发育早期调控，影响绒毡层形成，小孢子发育受阻；而超表达处理中，则主要调控成熟期的花药，影响绒毡层细胞 PCD 过程；表明AMS 对花粉育性可实现双向调控。采用超表达和基因编辑载体阳性植株于花期不同时期（四分体时期及成熟花粉期）进行取样，开展转录组测序。分析同一调控方式下两个时期及不同调控方式同一时期的DEGs。对DEGs进行GO富集分析和KEGG分析。经统计基因编辑植株处理在花药发育四分体时期和花粉成熟期分别有8031、9908个DEGs，AMS基因超表达植物处理有5589、 9814 个DEGs，两个处理在两个时期均差异显著的基因有341个，其中，在不同调控下，有相反表达趋势的5个基因，推测这5个基因受AMS调控，与花药败育密切相关。.对共同差异显著基因进行GO分析发现DEGs主要富集在细胞内信号转导、膜蛋白复合物、花发育的负调控、伯醇代谢过程等条目中。KEGG代谢通路富集分析表明DEGs主要富集在脂类代谢、糖类代谢、植物激素信号转导等途径。醚脂质代谢和类固醇生物合成过程是AMS基因调控下脂质代谢的关键途径，脂肪酸修饰作用及以BR和ET途径为主引起的信号传导等，造成脂质代谢紊乱，绒毡层发育异常；糖代谢中淀粉与蔗糖的代谢对细胞壁的形成和降解有重要作用，花粉壁形成异常，致使花药败育。