基于Rho/ROCK信号通路的双黄连注射液致过敏样反应机制研究

The previous studies have shown that Shuanghuanglian injection(SHLI) can increase vascular permeability of animal skin, lung and other tissues, meanwhile, induce inflammatory exudation and other reactions. The SHLI-induced vascular hyperpermeability and inflammatory exudation can be reduced by given Rho kinase inhibitor in vivo. All above indicate that SHLI-induced anaphylactoid reactions probably may have a certain relationship with Rho/Rock signaling pathway. This project will use vascular endothelial cell transwell chamber culture models in vitro and guinea pigs allergic reaction models and mice anaphylactoid reaction models in vivo to investigate SHLI-induced allergic and pseudoallergic reaction, vascular hyperpermeability, expression of molecules of Rho / ROCK signaling pathway, influence of ROCK inhibitor and Rho siRNA on SHLI-induced vascular permeability. It is hypothesed that SHLI may induce Rho/Rock signaling pathway activation and then affect the activity of myosin light chain kinase(MLCK) and myosin light chain phophatase(MLCP) and regulate myosin light chain(MLC) phosphorylation leading to actin-myosin shrink and cytoskeleton restructuring.Those effect will result in the vascular hyperpermeability. The study aims to clarify the role and mechanism of Rho/ROCK signaling pathway in SHLI-induced anaphylactoid reactions and to provide basis for prediction and prevention of SHLI-induced anaphylactoid reactions.

前期实验显示动物注射双黄连注射液（SHLI）可致血管通透性增高，引发过敏样反应；给予Rho/Rho激酶（ROCK）信号通路中的ROCK抑制剂后可减轻SHLI诱导的过敏样反应,提示SHLI的过敏样反应可能与Rho/Rock信号通路有关。本项目拟进一步采用体外血管内皮细胞transwell chamber培养模型、体内豚鼠过敏反应和小鼠类过敏反应模型等，研究SHLI通过激活Rho/ROCK信号通路，影响肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)活性，调控肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化，进而通过细胞骨架重组引起血管通透性增高并导致过敏样反应的机制。通过Rho激酶抑制剂以及Rho siRNA预处理，验证Rho/ROCK信号通路参与SHLI所致的过敏样反应。本项目旨在阐明Rho/ROCK信号通路在双黄连注射液致过敏样反应中的作用及其机制，为SHLI过敏样反应的预测与防治提供基础。

本项目在前期基础上，采用体外血管内皮细胞transwell chamber培养模型、体内豚鼠过敏反应和小鼠类过敏反应模型等，研究双黄连注射液（Shuanghuanglian Injection，SHLI）通过激活Rho/ROCK信号通路，调控内皮细胞骨架重组，从而引起血管通透性增高，引发过敏样反应的机制；探讨通过Rho激酶抑制剂干预Rho/ROCK信号通路，从而阻断SHLI诱导的血管通透性增高，抑制过敏样反应发生的可能性。本项目旨在阐明Rho/ROCK信号通路在SHLI致过敏样反应中的作用及其机制，为SHLI过敏样反应的预测与防治提供基础。通过研究发现，SHLI可诱发豚鼠和小鼠出现以血管渗出增加和炎症反应为特征的类过敏反应；未诱导IgE介导的过敏反应；类过敏反应均具有剂量相关性。这一新的发现为临床上正确处理SHLI的不良反应提供了理论基础，为解决SHLI不良反应问题指出了研究方向。本项目还发现，Rho/ROCK信号通路激活，从而产生血管内皮细胞骨架调整，致使血管通透性增高，是SHLI类过敏反应产生的重要机制之一。另外，在本研究基础上，我们建立了SHLI类过敏物质筛选方法和技术，找出了SHLI引起类过敏反应的主要成分，为其生产工艺和质量控制方法的改进提供了坚实的基础。.本项目已经完成了全部研究内容，在国内外学术期刊发表论文12篇，其中SCI收录4篇。课题负责人作为副主编出版著作1部。培养了2名博士、2名硕士。课题负责人于2016年8月赴香港参加了“中医药规范研究学会第五届年会暨《本草纲目》与中药创新药物研发高峰论坛”国际会议，做了“Problems and Countermeasures of Safety Evaluation of Traditional Chinese Medicine”的大会报告；并于2016年11月赴泰国参加泰国皇太后大学主办的“Mac Fah Luang International Conference（MFUIC 2016）”，做了“New Mechanism of Penicillin-induced Hypersensitivity Reactions”的大会报告。1名课题组成员赴奥地利维也纳大学合作研究半年，另1名成员赴日本东京药科大学合作研究1年。