纤毛虫酸性核糖体蛋白在蛋白质合成中的调控作用

本研究拟以八肋游仆虫为材料，通过对其酸性核糖体蛋白基因的克隆表达，分析其酸性核糖体蛋白的结构特点；通过建立稳定的酸性核糖体蛋白干扰细胞株，利用已建立的双荧光素酶检测体系，分析酸性核糖体蛋白对蛋白质合成的影响和调控机制，阐明酸性核糖体蛋白结构变化与纤毛虫翻译移码现象的相关性；通过基因定点突变、修饰等，研究酸性核糖体蛋白与延伸因子、肽链释放因子的相互作用位点与作用机理。研究结果将为阐明低等真核生物细胞内蛋白质合成的调控机制及从分子水平探讨生物进化提供新的实验数据。

本项目首次克隆单细胞原生动物八肋游仆虫酸性核糖体P蛋白基因(EoP0,EoP1,EoP2)，与其他真核生物序列比对发现游仆虫P蛋白具有特殊的C末端结构域。通过构建一系列P2突变体在体外表达并通过镍柱纯化，利用核磁共振、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及Phos-tag变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测P2蛋白的磷酸化作用以及磷酸化位点。利用pull-down检测P2蛋白与延伸因子2之间的相互作用位点，通过定点突变体外模拟P2的磷酸化作用，进一步研究磷酸化P2在蛋白合成延伸过程的调控作用。该项目研究结果为探讨低等真核生物酸性核糖体磷酸化蛋白在蛋白合成过程中的重要作用提供理论依据以及数据支持。