基于Rho A/ROCK信号通路研究苦豆碱抑制肺动脉高压的作用及机制

Aloperine is one of the main alkaloid extracted from Ningxia Hui medical herb Sophora alopecuroides.L.Our preliminary experimental results show that aloperine has a good reverse effect on pulmonary arterial hypertension.On the basis of the preliminary work, pulmonary hypertension rat model and rat's pulmonary arterial smooth muscle cells proliferation model will be employed combined with the skills of immunohistochemistry, cytology, molecular biology and other modern techniques.By examing the impact of blood flow dynamics, right ventricular hypertrophy index,pulmonary vascular remodeling,smooth muscle cell proliferation inhibition rate,proliferating cell nuclear antigen and cell cycle on holistic,cellular and molecular level to study the inhibition effect of aloperine on the pulmonary hypertension. Through analyzing the expression of Nitric oxide,Endothelin-l,Rho A,ROCK, Endothelin A,Endothelin B,p27kipl ,the association between the protective effect of aloperine in the pulmonary hypertension and the Rho A/ROCK pathway,which is the main signal pathways in the regulation of pulmonary hypertension is to be detected,so as to clarify molecular mechanism of aloperine on pulmonary hypertension, provide some help for the research on the clinical application of aloperine in pulmonary hypertension and experimental evidences for the expansion of Ningxia local recourse into economical advantages.

苦豆碱是从宁夏特色植物苦豆子中提取的主要生物碱之一。课题组前期研究结果提示苦豆碱对野百合碱致大鼠肺动脉高压具有良好的逆转作用。本研究拟在前期工作基础上，复制大鼠肺动脉高压模型和原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖模型，利用组织学、细胞学、分子生物学等现代技术，从整体、细胞和分子水平，通过检测大鼠血流动力学、右心室肥厚指数、肺血管重构、肺动脉平滑肌细胞增殖抑制率、增殖细胞核抗原、细胞周期等指标，系统研究苦豆碱对肺动脉高压的抑制作用；通过对NO、ET-1含量、Rho A、ROCK、ETA、ETB和p27kipl等指标的检测与分析，探讨苦豆碱对肺动脉高压的抑制作用与调控肺动脉高压的主要信号通路Rho A/ROCK的关系，以期阐明其作用机制，为研究苦豆碱应用于肺动脉高压的治疗，进一步探讨肺动脉高压的发生机制，为抗肺动脉高压药物的发展提供新思路，也为宁夏地方资源优势转化为经济优势提供基础理论和实验依据。

苦豆碱（Aloperine，ALO）是一种从宁夏特色植物苦豆子（Sophora flavescens Ait）中提取的喹诺里西啶类生物碱。本项目通过构建大鼠肺动脉高压模型，从整体、细胞和分子水平，观察苦豆碱对肺动脉高压的保护作用及其分子机制。结果：（1）与模型组比较，苦豆碱高剂量组（100mg/kg）能显著降低肺动脉高压大鼠mPAP和RVSP（P<0.01）。（2）H.E.染色显示与模型组比较，苦豆碱高剂量组（100mg/kg）能显著降低肺动脉高压大鼠的WT%、WA%、AD等心肺重构指标（P<0.01）。（3）超声心动图结果表明与模型组比较，ALO（100mg/kg）能显著改善肺动脉高压大鼠的PAAT和PAD参数，缓解右心室壁的肥厚和RV收缩期内径以及RV舒张期内径的异常增大（P<0.01和P<0.05）。（4）模型组比较，ALO(100 mg/kg)组大鼠肺组织中胶原纤维生成减少。（5）电镜结果显示与模型组比较，ALO(100 mg/kg)组大鼠肺血管内皮细胞损伤程度减轻。（6）分光光度法实验表明与模型组相比，SOD、CAT、T-AOC、等表达量显著上升（P<0.01和P<0.05）；MDA表达量显著下降（P<0.01）。（7）与模型组比较，ALO(100 mg/kg)组大鼠肺组织中α-SMA、PCNA、ET-1等表达量显著下降；（8）Western blot结果显示Rho A、ROCK1、ROCK2等蛋白表达显著下降（P<0.01和P<0.05）；t-MYPT1蛋白表达无影响（P>0.05）。（9）6. RT-qPCR结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肺组织中Rho A(P<0.05)、ROCK1(P<0.05)和ROCK2 mRNA的表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，苦豆碱(100mg/kg)能显著降低Rho A(P<0.05)、ROCK1(P<0.05)、ROCK2(P<0.05)mRNA的表达。结果显示苦豆碱通过抑制肺组织的氧化应激和炎症反应改善血流动力学指标和肺中小动脉的重构。本项目首次对苦豆碱对野百合碱诱导的肺动脉高压的保护作用及相关机制进行了系统研究，填补了该药在肺动脉高压研究方面的空白。研究结果不但为充分开发和利用我区的优势原料药苦豆子生物碱类，将资源优势转化为经济优势，也为新型治疗肺动脉高压药物的开发提供了实验室基础研究数据。