沙棘多糖对巨噬细胞TLR4/NF-κB和SOCS途径的调控作用及其对内毒素性肝损伤的保护机制研究

Sea buckthorn has been used in medicine for a long history. Seabuckthorn polysaccharide is one of the main active ingredient of Seabuckthorn, and little research is done on the mechanisms of its immune regulation. We isolated and purified seabuckthorn polysaccharide from the seabuckthorn fruit. Further study showed that seabuckthorn polysaccharide can promote the growth of macrophages and enhance phagocytic activity at a dose-depedent manner. Seabuckthorn polysaccharide can promote the expression of TNFα, IL-1β and IL-6 of macrophages, and the immune activation effect can be reversed by the inhibitor of NF-κB. We propose seabuckthorn polysaccharide may function through TLR4-NF-κB signaling pathways. The project intends to further analysis of the physical and chemical properties and structure of seabuckthorn polysaccharide,and study the effect and mechanisims of seabuckthorn polysaccharide on the expression of cytokines in macrophages. Using the methods of antobodies blocking and gene knocking out, we want to clarify the main receptors for seabuckthorn polysaccharide .The study of seabuckthorn polysaccharide on the signaling pathways of NF-κB and SOCS in LPS-activated macrophages will carried out accordingly. Using the mice model of liver injury, the anti-inflammation effect of seabuckthorn in vivo will be revealed. The methods of transcriptome will be used to clarify the corresponding mechanisms. Research on the project may not only helps to clarify the mechanism of action of seabuckthorn polysaccharide, but also lay the foundation for the further exploitation of this plateau sacred fruit.

沙棘在医药中的应用有着悠久的历史。沙棘多糖是沙棘的主要有效成分之一，关于其免疫调控机理研究甚少。我们从沙棘果中分离和纯化了沙棘多糖。进一步研究表明，沙棘多糖可以剂量依赖地促进巨噬细胞的生长和提高吞噬活性。沙棘多糖能够促进巨噬细胞表达TNFα、IL-1β和IL-6，该免疫激活效应可以被NF-κB的抑制剂所逆转。在此结果上我们提出沙棘多糖可能通过TLR4-NF-κB发挥免疫调节效应。本项目拟进一步分析沙棘多糖的理化性质和结构，研究沙棘多糖对巨噬细胞分泌细胞因子的影响和机制。通过抗体阻断实验、基因敲除实验证实沙棘多糖的主要作用受体，研究沙棘多糖对LPS活化的巨噬细胞中NF-κB和SOCS信号转导通路的影响。利用小鼠内毒素肝损伤模型，揭示沙棘多糖的体内抗炎效应，采用转录组学研究方法揭示其作用机制。本项目的研究不仅有助于阐明沙棘多糖的作用机制，而且为进一步开发利用沙棘这一高原圣果打下基础。

沙棘果在唐代时就作为药材在蒙医和藏医中使用。沙棘果中还有多种活性物质，其中沙棘多糖含量最高。本项目对分离纯化后的沙棘多糖组分HRP-a进行了紫外光谱、HPLC的验证，并通过HPLC进行了单糖组成分析。通过红外光谱对多糖结构进行了分析，并通过凝胶滤过法测定了沙棘多糖的分子量。通过抗体阻断实验以及抑制剂法研究了沙棘多糖的可能作用受体。采用LPS／D-GalN以及CCl4诱导的肝损伤模型研究了沙棘多糖对两种肝损伤的保护作用以及机制。此外，还研究了沙棘多糖对新城疫病毒疫苗的佐剂作用。重要研究结果如下：.1.沙棘多糖HRP-a主要由5种单糖构成，它们是Man、Rha、Glu、Gal和Ara，它们在沙棘多糖中的百分含量为12.73%、5.86%、26.71%、6.30%、48.41%，摩尔比为2.02：1.02：4.24：1：9.22。分子量为275420Da。.2.红外光谱显示HRP-a 具有典型的多糖基团如-OH，-CHO，C-O-C糖基化环以及C-O结构。.3.沙棘多糖并不通过TLR4受体来发挥作用。TLR4下游的NF-KB，PKA抑制剂作用后抑制了沙棘多糖诱导的细胞因子的表达。沙棘多糖能够抑制LPS诱导的炎症因子的表达。.4.沙棘多糖可以降低LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤，表现为降低ALT、AST水平，改善肝组织病理变化，降低MDA过氧化水平，提高SOD和GSH-PX的酶活力。.5.沙棘多糖抑制了LPS/D-GalN诱导的TLR4的表达，抑制了MAPK（ERK，JNK，p-38）的磷酸化，抑制了NF-KB的磷酸化以及入核。沙棘多糖抑制了Bax的表达，提高了BCL2/Bax比值。在LPS/D-GalN作用后SOCS3应激性表达增高，沙棘多糖作用后低剂量组进一步促进的SOCS3的表达，但是在中剂量和高剂量组变化不大，表明沙棘多糖可能不是通过上调SOCS3的表达来发挥抗炎作用。沙棘多糖对PPAR-γ的表达影响也不大。结果提示，沙棘多糖是通过抑制TLR4-NF-KB信号转导通路以及通过抑制凋亡来发挥了抗炎抗氧化作用。.6.沙棘多糖能够剂量依赖行地保护CCl4诱导的急性肝损伤，作用机制也是通过抑制TLR4-NF-KB信号通路。.7.沙棘多糖对新城疫病毒疫苗具有佐剂效应，表现为促进淋巴细胞增殖，提高新城疫抗体的滴度和IL-4和IFN-γ。