囊泡转运蛋白Rab7对位于胞内体的TLR3/TLR7/TLR9介导的I型IFN表达的调控及机制研究

The production of tpe I IFN mediated by endosomal TLR3/TLR7/TLR9 plays an important role in autoimmune diseases. Negative regulating molecules to such receptors are less known.lysosome-associated Rab7 is one member of Ras family, responsible for vesicle transport. Our previous results indicate that Rab7 can negatively regulate LPS/TLR4 signaling pathways. Furthermore, Rab7 expression was induced by TLR3 ligand and inhibited TLR3-mediated IFN-β production. We speculate that Rab7 could negatively regulate TLR3/TLR7/TLR9 signal pathways.Using the methods of interference and overexpression and combined with the reporter gene methods, the role of Rab7 and its domain in type I IFN production mediated by the above receptors will ba ananlyzed. The effect of Rab7 on the MAPK and IRF will be clarified. Using the methods of co-immunoprecipitation and laser confocal microscopy, the regulation of Rab7 on the transpot and orientation of TLR3/TLR7/TLR9 will be learned. After fulfill the project,the regulatory mechanisms of intracellular TLRs signal transduction will be enriched and new target for clinical treatment of autoimmune diseases may be found.

位于胞内体的TLR3/TLR7/TLR9活化后产生的I型IFN在自身免疫性疾病中扮演重要角色，关于该类受体的负向调节分子研究不多。Rab7是定位于溶酶体的负责囊泡转运的Ras 家族成员之一。我们以前的研究结果表明，Rab7可以负向调控LPS/TLR4信号转导途径。进一步地，Rab7在TLR3配体刺激下表达增高，负向调节了TLR3介导的IFN－β的表达。我们推测定位于Rab7可以负向调节TLR3/TLR7/TLR9信号通路。本文拟采用Rab7干扰和过表达技术，结合报告基因方法，检测Rab7对三类受体活化后I型IFN表达的影响，明确Rab7发挥作用的结构域，阐明Rab7对MAPK以及IRF 信号途径的影响。进一步通过免疫共沉淀和激光共聚焦显微镜技术研究Rab7与三类TLR受体的结合定位和转运过程。该项目的研究不仅丰富了胞内TLRs受体信号转导的调控机制，而且为临床治疗自身免疫性疾病提供新的靶点

TLR3/TLR7/TLR9不仅在天然免疫应答而且在自身免疫性疾病中发挥重要作用。本项目采用TLR3/TLR7/TLR9配体激活巨噬细胞后检测了Rab7的表达，检测Rab7对TLR3/TLR7/TLR9介导Ⅰ型IFN及其他炎性细胞因子的表达的影响。检测了Rab7对TLR3/TLR7/TLR9介导的信号转导通路的影响。采用质粒定点突变的方法构建了Rab7的失活突变载体Rab7T22N 以及Rab7的Rab7ΔC末端突变体，研究Rab7发挥作用的功能结构域。检测了Rab7的细胞内定位以及对于TLR9受体表达的影响。重要结果如下：.1.Rab7 mRNA在TLR3/TLR7/TLR9的配体刺激下表达都增高，在6-8h时达到高峰，随后表达降低。这一趋势与位于Rab7上游的早期内体相关的Rab5a的表达模式一致。.2.Rab7干扰后对PolyI:C激活的TLR3下游的TNF-α和IL-1β具有促进作用。Rab7干扰后也显著促进了IRF3调控的IFN-α和IFN-β的表达。R848和CpG刺激Rab7干扰的巨噬细胞6h后，Ⅰ型IFN及其他细胞因子的mRNA水平都显著增高。.3.Rab7过表达后显著抑制了R848刺激的巨噬细胞中细胞因子的表达。稳定表达Rab7的失活突变质粒Rab7T22N后，I型干扰素以及其他细胞因子表达显著增高。Rab7T22N能够促进CpG诱导的I型干扰素以及IL-1β和IL-6的表达。.4.Rab7的C末端缺失后逆转了Rab7对PolyI:C诱导的细胞因子的抑制效应，促进了TNF-α、IL-6、IFN-α和IFN-β的表达。.5.Rab7干扰后，在PolyI:C ，R848和CpG的刺激下ERK的磷酸化水平都显著增高。 在PolyI:C刺激后p38的磷酸化水平也显著增高，在CpG刺激后JNK剂的磷酸化也显著增高。Rab7的C末端缺失后显著提高了polyI:C诱导的ERK，JNK和p-38的磷酸化水平。.6.采用共聚焦显微镜检测Rab7的定位，发现Rab7和LAMP-1共定位，说明Rab7定位在溶酶体结构。.7.Rab7过表达后并未显著降低TLR9的表达，Rab7的C末端缺失后，TLR9的表达并未显著提高。