新型海洋低温几丁质酶持续作用机制的研究

Chitinase(chi), a key enzyme involved in the chitin degradation of the marine environments. The high processivity is the key factor for the degradation of insoluble and crystalline chitin and can be potentially utilized in bioconversion of chitin to chitin oligosaccharides, to replace the traditional way of chitin oligosaccharides production by chemical methods. However, mainly due to less understanding about the processivity mode of chi, chitin is yet hard to be handled by chi. Previously, we reported a high-activity chi isolated marine bacteria, designated Pseudoalteromonas sp. DL-6.The chiC cloned from the strain is a novel gene and has a novel processive mode based on its comparison of structures with other reported chitinases. Therefore, in this research, we would like to illustrate its processive mechanism through enzyme reaction with chitin oligosaccharides and chitosans varying fraction of acetylated units (FA), and quantitative analysis of the end products. Ultimately, we would like to understand how this novel chi recognizes and binds chitin at the molecular level and also how the subsequent reactions occur. All these information is deemed to be critical in clean production of chitin oligosaccharides.

几丁质酶（chi）是海洋环境几丁质新陈代谢的关键酶，可作为催化剂生物转化制备几丁寡糖，它的高持续性作用是降解晶体几丁质关键因素，一旦被规模放大，即可替代现行化学法，实现几丁寡糖产业绿色转型，经济和生态意义重大。目前瓶颈是chi酶解效率低，对chi持续机理研究较少，用于大规模生物转化理论基础不足。申请者前期从海洋底泥筛选到高活性chi菌株Pseudoalteromonas sp. DL-6，初步结构分析其分泌的chiC具有新型持续性作用机制，对其深入研究为chi产业化应用提供重要依据。本申请拟通过chiC与不同聚合度几丁寡糖及不同乙酰度壳聚糖的反应，对所得复杂寡糖产物定性定量分析，结合酶动力学，确定chiC与几丁寡糖及壳聚糖的结合位点和模式。最终，在分子水平上阐明chi识别机理和反应机制，验证chiC持续性反应机理，为提高chi酶解效率，实现几丁寡糖产业大规模绿色转型提供理论基础和新颖途径。

几丁质酶是海洋细菌利用几丁质为碳源和氮源的关键酶，它的高持续性是不溶晶体几丁质降解最关键因素，可以作为催化剂促成生物转化制备几丁寡糖，一旦被规模放大，即有可能替代现行的化学法，实现几丁寡糖产业绿色转型，经济和生态意义重大。规模放大的瓶颈是chi酶解效率低，对chi催化机理研究较少，将其用于大规模生物转化的理论基础不足。. 项目负责人在本项目前期工作中，从Pseudoalteromonas sp. DL-6中筛选得到一种高活性的低温几丁质酶，初步的研究表明该酶可能具有新型的持续性反应模式，对于它的深入研究有可能为海洋低温几丁质酶的产业化应用提供重要依据。 . 为了揭示该酶的持续性反应模式这一关键科学问题，我们主要的研究内容包括几丁质酶基因的克隆及生物信息学分析，重组蛋白的表达纯化及酶学性质表征，酶的反应动力学研究，酶与不同聚合度几丁寡糖与65%乙酰度的壳聚糖的持续性反应模式研究，以及酶降解晶体几丁质底物的产物分析等。 . 通过本研究，我们调取Pseudoalteromonas sp. DL-6的几丁质酶基因，全长2631bp，理论分子量92.65939KDa，除类型3几丁质结合域外包含免疫球蛋白、成人多囊肾病等独特结构域，且存在3个持续性作用的关键Trp。ChiC具有适冷特性，在4 °C以胶体几丁质为底物的Kcat/Km分别为0.56和1.83。此外，ChiC表现出较强的耐盐特性，在5 M NaCl下仍保持最高酶活的60%以上。ChiC只能与聚合度大于3的几丁寡糖进行反应，为持续作用底物生成几丁二糖的外切几丁质酶。除晶体几丁质外，ChiC还可以降解不溶晶体底物Chitosan和Avicel等，具有广泛的底物适应性。本研究几丁质酶具有独特的酶学特性、结构特征与持续性的作用模式，具有重要的科学意义，不仅为生物酶法规模化制备几丁寡糖提供理论基础，也有助于进一步阐明海洋环境几丁质代谢机制。