杨树几丁质酶基因家族抗病原真菌的作用机制研究

Chitin is the main structural component in fungal cell wall. While no chitin was found in plants, plant species usually contains large number of chitinases which catalyze the hydrolysis of chitin. Why plants need so many chitinase genes, if functional divergence exists among chitinase gene members, and what is the mechanism of functional divergence? To address these questions, we will conduct systematic studies on the chitinase supergene family in Populus trichocarpa. First, we will identify all the chitinase genes in P. trichocarpa. Second, the gene expression patterns of this gene family responding to fungi will be examined using real-time RT-PCR. Third, the chitinase proteins will be expressed in E. coli, the biochemical characterization of the purified recombinant proteins will be investigated. By integrating sequence data, gene expression and protein biochemical characterizations, this study will shed light on the antifungal mechanism of chitinase supergene family in P. trichocarpa. The results of this study will facilitate us to understand the pattern and mechanism of functional divergence of disease-related supergene family in forest trees.

几丁质是真菌细胞壁的重要成分，植物中并不含有几丁质，但植物中却含有能够催化几丁质水解的几丁质酶，并且由大型基因家族所编码。植物为何需要如此众多的几丁质酶基因？这些基因的功能是否有分化？分化的机制是什么？为了回答这一系列问题，本课题以模式林木植物杨树为研究材料，综合基因序列、基因表达模式和蛋白质生化功能分析，研究杨树几丁质酶基因家族响应病原真菌的模式、基因家族成员的蛋白质功能、以及成员间的功能差异，阐明杨树几丁质酶基因家族抗病原真菌的作用机制，从而逐步揭示林木大型抗病基因家族的功能分化模式和分化机制。

几丁质酶基因家族在植物抗病原真菌过程中发挥重要作用。本课题以模式林木植物杨树为研究材料，在“基因序列—基因表达—蛋白质功能”层次上，研究杨树几丁质酶基因家族的进化模式、响应胁迫的模式和蛋白质催化功能。本研究从杨树全基因组中挖掘到48个全长几丁质酶基因，系统发生关系分析将这些基因归为四种类型（I, II, III和IV）。蛋白结构域分析发现不同几丁质酶类型具有不同的结构域组成。类型I和II只含有糖苷水解酶18（GH18）结构域。部分类型III几丁质酶除含有GH18结构域外，还含有蛋白激酶结构域。类型IV中大部分几丁质酶均含有几丁质结合结构域和糖苷水解酶19（GH19）结构域。基因组定位分析发现在48个杨树几丁质酶基因中，37个在染色体上成簇分布，表明串联重复在杨树几丁质酶基因家族的扩张中发挥重要作用。选择压力分析发现杨树四种类型几丁质酶基因均受到纯化选择压力。利用反转录PCR进行的基因表达模式分析发现杨树几丁质酶基因家族的表达模式发生了广泛的分化。18个杨树几丁质酶基因在所有的样品中均表达，5个在任何组织中均未检测到表达，而另外25个基因只在某些组织或者受到某种胁迫条件下表达。酶学活性分析发现杨树几丁质酶类型I, II和IV均对几丁质和几丁聚糖有活性，但对底物的偏好不同。蛋白序列分析发现部分类型III杨树几丁质酶缺乏催化所必须的活性位点，预示这些蛋白不能执行催化几丁质水解的功能，它们可能在感受并传递真菌侵染信号方面发挥作用。综合基因序列特征、分子进化、基因表达模式和蛋白质生化功能分析，本研究揭示了杨树几丁质酶基因家族的分化模式和分化机制，发现杨树几丁质酶基因家族广泛响应生物胁迫。本论文的研究结果对理解杨树抗病原真菌的分子机制具有重要的理论意义。