LncLEPIS/HuR/TMOD4途径对肝脏胆固醇代谢以及动脉粥样硬化形成的影响及机制研究

Although the role of lncRNA in the development of AS has been significant in recent years, there are still few knowledge on the involvement of lncRNA and its downstream target genes in liver cholesterol metabolism and AS formation. Our previous study found a new lncRNA: lncLEPIS, which is associated with cholesterol metabolism and AS formation.①Inhibition of lncLEPIS and its potential target gene TMOD4 could reduce the content of cholesterol in hepatocytes respectively. ②Silencing lncLEPIS can inhibit the expression of TMOD4. ③The RIP assay found that the RNA binding protein HuR binds directly to lncLEPIS and the mRNA of TMOD4. Therefore, we propose that the hepatocyte lncLEPIS/HuR/TMOD4 pathway may affect blood lipid levels and AS formation by regulating liver cholesterol metabolism. This project aims to explore the effect of lncLEPIS/HuR/TMOD4 pathway on hepatic cholesterol metabolism, blood lipid levels and AS and relevant mechanisms by enhancing/inhibiting the expression of lncLEPIS and/or HuR and/or TMOD4, to provide a scientific basis about this pathway as an improvement of blood lipid levels and new targets for the prevention and treatment of AS.

虽然近年来lncRNA在AS的发生发展中的作用受到重视，但关于lncRNA及其下游靶基因参与肝脏胆固醇代谢从而影响AS的研究仍然较少。我们的前期研究发现了新的与胆固醇代谢以及AS形成相关的lncRNA：lncLEPIS，①分别抑制lncLEPIS以及其潜在靶基因TMOD4均可减少肝细胞内胆固醇的含量；②沉默lncLEPIS可抑制TMOD4的表达，并且③RIP实验发现RNA结合蛋白HuR可直接与lncLEPIS和TMOD4的mRNA结合。因此，我们提出肝细胞lncLEPIS/HuR/TMOD4途径可能通过调控肝脏胆固醇代谢，影响血脂水平和AS的形成。本项目拟通过增强/抑制lncLEPIS和/或HuR和/或TMOD4的表达，观察lncLEPIS/HuR/TMOD4途径对肝脏胆固醇代谢、血脂水平以及AS的影响，并探讨相关机制，为确定该途径可作为改善血脂水平和防治AS的新靶点提供科学依据。

降低LDL-C仍然是防治AS和降低患者MACEs发生率的“基石”。LncRNA可通过调节肝脏胆固醇代谢影响AS的发生发展，是防治AS的潜在基因靶点。本课题在动物水平上经ApoE-/-小鼠尾静脉分别注射特异性过表达肝细胞lncRNA（LEPIS）的腺相关病毒AAV-LEPIS以及特异性过表达肝细胞TMOD4的腺相关病毒AAV-TMOD4，构建肝细胞LEPIS过表达的ApoE-/-小鼠和肝细胞TMOD4过表达的ApoE-/-小鼠模型，观察肝细胞LEPIS以及TMOD4上调对小鼠血脂相关指标、炎症因子以及AS病变的影响。另外在细胞水平上，提取小鼠原代肝细胞的同时使用腺病毒转染HepG2细胞，构建过表达LEPIS以及TMOD4的细胞模型，观察LEPIS以及TMOD4的表达对肝细胞胆固醇代谢影响及详细机制。使用腺病毒和siRNA转染HepG2细胞，构建过表达LEPIS和过表达LEPIS+沉默TMOD4的细胞模型，观察TMOD4是否介导LEPIS对肝细胞胆固醇代谢的影响。使用腺病毒和siRNA转染HepG2细胞，构建过表达LEPIS和过表达LEPIS+沉默HuR的细胞模型，观察HuR是否介导LEPIS对TMOD4表达的调控及相关机制。经过上述实验，本课题得出以下研究结果：LEPIS可能通过TMOD4参与调节肝脏胆固醇代谢，影响动脉粥样硬化的发生和演变；在肝脏中过表达LEPIS和TMOD4可促进AS的发生；在肝脏中过表达LEPIS和TMOD4可降低斑块的稳定性。肝脏中LEPIS或TMOD4的过表达增加了血脂水平，升高肝细胞PCSK9的水平，降低LDLR的水平，使肝细胞内的胆固醇含量升高；LEPIS通过TMOD4升高PCSK9，降低LDLR的水平；LEPIS通过促进HuR向细胞质转移，增加TMOD4mRNA的稳定性；TMOD4通过影响PCSK9启动子的转录活性来调控PCSK9的表达。综上所述，本课题研究表明：肝脏LEPIS通过与RNA结合蛋白HuR相互作用，促进HuR从细胞核到细胞质的转移，从而增强了TMOD4的表达。TMOD4通过与PCSK9的启动子结合，上调其转录活性，增加了PCSK9的表达，降低LDLR的水平，这进而导致肝细胞胆固醇摄取受损，血浆中LDL-C水平升高，最终促进了AS的发生和发展。因此，本课题研究表明，LEPIS有望成为预防和治疗AS的有效新靶点。