蚊媒抗药性的转录组学研究

Mosquitoes transmit many mosquito-borne diseases such as malaria, dengue fever, which pose significant threats to public health. Among all applicable strategies, chemical control playes a critical role in controlling disease-spreading vectors. Unfortunately, excessive and continuous usage of insecticides induced the development and spread of insecticide-resistance, which presents the major obstacle to arbo-diseases control. Previous results pointed out that multiple genes are involved in the insecticide resistance. To fully clarifying the mechanism of insecticide resistance and to manage insecticide resistance, new insecticide resistance genes need to be identified and characterized. In the present study, deep sequencing transcriptome will be used to identify differentially expressed genes on a large scale between two Culex pipiens pallens strains with well-defined pyrethroid-sensitive and -resistant phenotypes. Then, the high-throughout sequencing results will be confirmed by realtime PCR. Furthermore, putative candidate gens will be selected for further functional analysis. This study will effectively discovering unknown resistance genes, and reveal the comprehensive polygene regulation of insecticide resistance. Moreover,it will help fully understand the underlying molecular mechanism of insecticide resistance, and have great application potential in insecticide-resistance management.

蚊传播疟疾、登革等多种疾病（蚊媒病），严重危害人类健康。化学防制一直是蚊媒综合治理的主要方法。杀虫剂大量、持续使用导致了蚊杀虫剂抗性（抗药性）的发生和发展，已成为蚊媒病防制工作的最大障碍。抗药性是多基因参与的综合表型，目前已知基因不能完全阐明抗药性的分子机制，因此发现和鉴定新的蚊媒抗药性相关基因，有助于阐明抗药性的分子基础和治理抗药性。本项目采用高通量测序方法，对淡色库蚊拟除虫菊酯敏感和抗性品系进行转录组测序，大规模分离和鉴定表达差异基因。随后利用定量PCR 的方法对转录组测序结果进行验证，结合生物信息学分析以及文献检索，以期发现蚊媒抗药性发生发展的关键性基因，并进行相关功能验证。本研究不仅有效鉴定未被发现的抗药性相关基因，更有利于对抗药性相关的多基因调控作用进行初步探讨，拓宽对媒介抗性分子机理的认识，具有重要的理论意义以及潜在的应用价值。

蚊是重要的医学昆虫，能传播多种疾病。由于方便、高效和经济等特点，采用杀虫剂化学防制一直是蚊媒综合治理策略中的主要方法。 然而，杀虫剂长期、大量地使用导致了蚊抗药性的发生和发展。抗药性已经成为蚊媒病防制工作中的最大障碍。抗药性是多个基因、多重机制参与的复杂生物进化现象，没有某一个或一类已知基因能够完整阐明抗药性机制。全面系统寻找蚊抗药性相关基因并探寻其参与抗药性机制是蚊媒防制环节中亟待解决的问题。 . 本项目以淡色库蚊实验室种群溴氰菊酯敏感 品系和抗性品系为实验材料。 通过 Illumina-Solexa 高通量转录组测序（ RNA-seq），比较了2个品系预混样本的基因表达情况。 本次测序共检测到 4961197620 对碱基和 55124418 条 reads，匹配到致倦库蚊数据库后，组装成 17679 个已知基因。按照差异倍数大于 2 倍且假阳性率 小于 0.001 的标准， 共筛选到 1826 个差异表达基因，其中 1078 个基因在抗性品系中高表达， 748 个基因在抗性品系中低表达。 采用定量 PCR对部分基因差异表达分析结果进行验证，证实 RNA-seq 和 定量PCR 两种方法得到的基因差异表达分析结果趋势一致。参考 1826 个 DEGs 的 RPKM值及其在 敏感和抗性品系间的差异倍数，我们最终选取了 22个基因作为蚊抗药性相关候选基因。通过实验室和现场品系的进一步确认，我们最终确定 venom allergen 5 为后续功能验证候选基因。我们对该基因进行全长扩增，获得全长 912 bp，包含开放阅读框765 bp，编码 254 个氨基酸（ GenBank 登录号： KF723295.1）。为了证实 venom allergen 5 与蚊抗药性相关，我们随后进行了体外和体内功能验证。结果表明venom allergen 5 高表达能够显著降低蚊细胞对溴氰菊酯的敏感性，venom allergen 5 低表达能够显著增加雌蚊对溴氰菊酯的敏感性。这些结果表明， venom allergen 5 是一个新的蚊抗药性基因。. 本研究为蚊抗药性机制研究提供重要分子基础，也为现场抗药性检测提供了大量候选基因；证实 venom allergen 5 是一个新的蚊抗药性基因， 有望成为蚊抗药性检测靶标。