基于细胞因子佐剂及表型混合系统的重组减毒肠道病毒疫苗及粘膜免疫研究

Coxsachievirus B3 ( CVB3 ), the enterovirus B and single strand RNA virus, is one of commom pathogens which can cause Hand-foot and mouth disease (HFMD) and viral myocarditis. At present, there is no clinical effects of drugs and vaccines against CVB3 infection. Using reverse genetics technology, a low cell toxicity of recombinant CVB3 defective virus vaccine was obtained with China CVB3 Nancy strain deleted virus VP4 capsid protein gene as the carrier. The recombinant CVB3 defective virus can infect CVB3 cells, and express immunogenic virus VP1 protein, but can not rescue infectious progeny virus. Further more, restriction endonuclease site will be inserted in the CVB3 virus for exogenous gene experssion, which could be a basis platform for the research and development of multivalent recombinant defective CVB3 virus vaccine.The study will not only constuct a simple and effective vaccinate method, but also reveal the cellular and molecular mechanism invovled in the recombinant defective CVB3 virus vaccine caused immune response, by evaluating the immune protection effect and pathology damage degree accoding to animal experiment.

萨奇B3 (CVB3)属肠道病毒型，是手足口病病原之一，也是引起病毒性心肌炎最常见的致病原。目前临床上没有针对CVB3感染的特效药物和疫苗。本课题运用反向遗传学技术，以近年来在我国华南地区流行的CVB3 Nancy株为载体，通过缺失病毒VP4壳蛋白基因，获得低细胞毒性重组缺陷型CVB3病毒疫苗。该重组缺陷型CVB3病毒可以感染CVB3敏感细胞，并表达具有免疫原性的病毒VP1蛋白，但因VP4蛋白缺失而无法包装出有感染性的子代病毒。本项目进一步将在重组缺陷型CVB3病毒载体中，通过引入核酸酶切位点从而表达外源目的基因，为今后重组缺陷型CVB3病毒多价疫苗的研发提供基础平台。本研究在优化免疫条件的基础上，将建立高效，简便的免疫接种途径。通过动物攻毒实验评价重组缺陷型CVB3疫苗的免疫保护效果和免疫病理损伤程度，揭示重组缺陷型CVB3疫苗引发机体免疫应答所涉及的细胞和分子免疫机制。

肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，可引发包括手足口病、心肌炎、脑脊髓炎等多种中枢神经系统、心血管系统疾病，在儿童中尤甚。EV71、柯萨奇病毒A组16型（CVA16）是手足口病毒的重要病原，CVB3除引发手足病口外，对心肌和消化腺也具有破坏作用。肠道病毒具有表型混合特性，当多种肠道病毒感染同一细胞时，不同病毒来源的核心会被不同病毒的衣壳所包裹，如通过反向遗传系统，仅保留含有细胞因子佐剂的重组肠道病毒核心，细胞内有多种肠道病毒的衣壳蛋白，即可在避免干扰现象的基础上，获得多价重组肠道病毒，对疫苗应用有重要潜在价值。本课题以CVB3、EV71、脊灰Sabin I毒株为背景毒株构建感染性克隆和反向遗传系统、含有细胞因子佐剂的重组减毒CVB3毒株、以及多种毒株VP1抗原的表达细胞系，并通过分子流行病学分析VP1流行特征、检测重组病毒体内免疫效果等相关研究，建立完善系统。本课题完成了柯萨奇病毒B3（CVB3）的全基因组克隆和反向遗传系统构建、CVB3可携带负载外源基因片段的载体毒株的反向遗传系统、获得了携带EGFP示踪重组CVB3，以及细胞因子佐剂CXCL-10重组CVB3，完成减毒CVB3以及负载外源细胞因子CVB3毒株的在体免疫效果检测。为构建多价肠道病毒重组疫苗病毒，我们开展了针对EV71毒株的全基因组克隆和分析工作，完成了含有EV71-VP1的重组CVB3毒株载体的构建、EV71毒株的全基因组克隆和分析工作、构建了基于EV71毒株的反向遗传系统、对华中华南的EV71及CVA16流行毒株VP1的克隆与测序分析、EV71、CVA16及其它毒株VP1抗原重组蛋白表达细胞系的构建、脊髓灰质炎病毒Sabin疫苗毒株I型的全基因组克隆和反向遗传系统的构建、EV71/CAV16和脊灰Sabin毒株2A蛋白酶的真核表达质粒。进行了肠道病毒中枢神经系统致病性方面的研究，以及流感病毒中枢神经系统致病性的研究。目前申请了国家发明专利2项，培养研究生5名（毕业2名），发表论文6篇（SCI论文1篇），研究核心内容结果将在专利申请后进一步投稿发表。研究完成了课题既定研究目标。