拟南芥多铜氧化酶家族成员SKS11和SKS12在花粉萌发和花粉管伸长中的功能研究

Pollen grain germinates and produces a long pollen tube, which is the only way to transfer two sperm cells to female gametophyte in flowering plants. So the research on pollen germination and pollen tube growth is becoming one of hottest research fields in plant sexual reproduction. In agriculture, problems in pollen germination or pollen tube growth often cause fertilization failure as well as large scale reduction in food production of crops or money crops.SKU5 Similar(SKS)11, which belongs to multi-copper oxidase family, is highly expressed in pollen. However，the role of SKS11 in pollen germination and pollen tube growth is not clear. This project aims to identify the functions of SKS11 and its highly homologues gene SKS12 by various research methods, including genetics, cell biology, biochemistry and so on. And enzyme assay, pollen cell wall analysis and screening of proteins interacting with SKS11 or SKS12 will be performed to investigate the functions and mechanism of SKS11 and SKS12. This project will further our understanding of SKS gene family functions and molecular mechanism of pollen germination and pollen tube growth.

被子植物中花粉萌发并形成花粉管，是两个精细胞到达雌配子体的唯一途径，一直是植物有性生殖研究的热点领域之一。在农业生产中，花粉萌发或花粉管的伸长受阻均可致使受精失败，导致生产实践中农作物和经济作物的大量减产。隶属于多铜氧化酶家族的SKU5 Similar（SKS）亚家族成员SKS11特异地在花粉中高水平表达，但其在花粉萌发和花粉管生长中的功能尚不明确。本项目以SKS11及其高度同源基因SKS12为研究对象，拟通过分子遗传学、细胞生物学、生物化学等多种研究手段，开展SKS11和SKS12的功能研究。并通过酶活性检测、花粉细胞壁组分的分析、相互作用蛋白等实验，探究SKS11和SKS12的功能及其可能的作用机制，为揭示SKS基因家族成员的功能以及花粉萌发和花粉管伸长的分子机制，奠定坚实的理论基础。

花粉萌发与花粉管的伸长是被子植物中成功双受精的重要保障。基于我室拟南芥花粉萌发前后的差异蛋白质组学研究，本项目以两个在花粉和花粉管中特异表达的SKS11 (SKU5 similar 11 ) 与 SKS12 (SKU5 similar 12)为研究对象，探究在这两个蛋白在植物有性生殖中的重要功能。.研究结果表明sks11和 sks12 T-DNA插入单突变体雄配子的传递效率显著下降。sks11 sks12的角果严重败育，雄配子体传递效率下降为零。sks11 sks12的花粉体外萌发中花粉萌发率显著下降，部分花粉管发生破裂。sks11 sks12的花粉管在花柱道中的生长速率显著变缓。将SKS11/12基因组转入sks11 sks12 双突变体成功恢复了突变体的表型。不同组织的RT-PCR和GUS染色表明 SKS11和SKS12主要在花粉粒和花粉管中特异表达。对成功恢复sks11sks12双突变体表型的proSKS11::SKS11cDNA::GFP/sks11sks12 转基因植株进行荧光观察，结果显示 SKS11 - GFP主要定位在花粉管顶端，质壁分离试验进一步表明SKS11-GFP定位于细胞壁。花粉的超薄切片观察显示sks11sks12花粉管顶端细胞壁相比野生型内壁层加厚。sks11sks12花粉管细胞壁中低甲酯化同聚半乳糖醛酸，高甲酯化同聚半乳糖醛酸，鼠李糖半乳糖醛酸Ⅰ以及晶体化纤维素含量相比野生型花粉管显著增多且分布异常。此外，应用H2DCFDA对花粉管胞内ROS含量进行检测发现sks11sks12花粉管胞内ROS水平相比野生型显著下降。最后，利用定点突变的方法对SKS11和SKS12中残留的铜离子结合位点保守的组氨酸进行功能分析。结果表明突变形式的蛋白仍能够成功恢复突变体的表型。.拟南芥中SKS家族与多铜氧化酶序列相似性很高，但缺少保守的铜离子结合位点。人们对其中大部分成员的功能尚不明确，它们是否仍具有多铜氧化酶的活性也不清楚。本研究明确了拟南芥中花粉和花粉管特异表达的SKS11和SKS12在花粉萌发和花粉管伸长中的重要作用，而且初步揭示了二者可能通过调节花粉管细胞壁的重塑和胞内ROS的水平的作用发挥功能。这为拟南芥中类多铜氧化酶家族的功能研究积累了重要的数据和线索，也为将来在农业生产实践中，培育高产新品种提供了重要的理论依据。