肿瘤特异启动子调控的荷载shRNA溶瘤腺病毒对肝癌干细胞特性及靶向放射治疗的影响

肿瘤干细胞是肿瘤发生、转移、肿瘤放化疗抵抗的重要原因。为了探索针对肿瘤干细胞新的治疗策略，必须研究和搜寻肿瘤干细胞特异的、能与机体正常组织相区别的新靶点。但在机体或同一组织中，肿瘤干细胞和正常干细胞有着某些相似的表型和调节机制。因而本课题在以前研究基础上探索如何仅特异针对肿瘤干细胞本身进行有效显像诊断和治疗，避免杀伤正常组织细胞和正常干细胞。因此，本课题利用溶瘤腺病毒携带靶向肿瘤干细胞的治疗基因CD133-shRNA，并在基因水平利用肿瘤特异性启动子Survivin调控溶瘤腺病毒的复制，使其特异分布于肿瘤组织，避免对正常组织产生照射损伤，发挥溶瘤腺病毒介导外源基因特异表达及杀伤肿瘤细胞两种功能，实现其对肝癌干细胞的靶向治疗作用及增加放疗增敏性。还通过shRNA沉默或下调CD133表达，探讨CD133在肝癌干细胞干性维持中的生物学功能。

重要研究进展.本课题已完成申请书预定的研究内容，成功构建了survivin 启动子调控的shRNA真核表达载体pEntry-SUR-GFP-shRNA。经脂质体转染HeLa细胞 293T细胞，HepG-2细胞后，证明survivin具有肿瘤特异性,并且在HepG-2细胞的表达程度高于HeLa细胞，RT-PCR检测HepG-2细胞中GFP基因的mRNA表达间接证明该表达是由于Survivin基因启动。（2）RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭CD133基因表达；(3)RT—PCR和westemblot检别显示转染pAd-SUR-GFP—shRNA(972).pAd-SUR-GFP—shRNA2377.pAd-SUR-GFP—shRNA482后CDl33 mRNA和蛋白表达均受到显著抑制，与未转染组和pAd-SUR-GFP-shRNA NC组相比，pAd-SUR-GFP—shRNA(972）组细胞凋亡比例明显增加(P<O．05)；pAd-SUR-GFP—shRNA (972）组细胞的增殖和侵袭能力也受到显著抑制(P<O．05)。.深入和扩展了以下研究成果：1.用茶多酚（EGCG，0-50 μM)呈剂量依赖性抑制鼻咽癌干细胞的细胞活性、克隆形成、迁移力、并逆转EMT特性（P < 0.05或P < 0.01）；EGCG联合顺铂能抑制鼻咽癌干细胞的裸鼠成瘤能力(n = 4; P<0.01)，且能有效地抑制成瘤组织中干性基因及EMT标志物的表达；EGCG抑制NF-κB p65核内转位及serine536 位点的P65磷酸化而抑制P65活性（P < 0.05或P < 0.01）；构建慢病毒载体沉默P65能有效抑制鼻咽癌干细胞的迁移、自我更新能力，并抑制干性基因bmi-1、Twist1的表达及逆转EMT（P < 0.05或P < 0.01）；EGCG或shp65均能有效抑制Twist1启动子活性，两者联合干预对Twist1启动子活性有显著抑制效应（P < 0.05或P <0.01），揭示了EGCG能抑制NF-κB p65对Twist1的转录调控，呈剂量依赖性抑制鼻咽癌干细胞的细胞活性、克隆形成、迁移力。