基于微构重塑技术构建大型预血管化工程组织

本项目将继续以组织"微构重塑技术"为核心，在前期研究和认识了微组织构建及调控策略的基础上，紧紧围绕工程化组织体外构建过程中及移植体内后存在的传质限制问题，通过研究通道间距与流体流动对物质传递、组织形成及功能特性的影响与规律，认识构建大型多通道工程化组织对微组织组装过程及其操作参数控制的要求，建立能消除或缓解大型工程化组织体外构建过程中传质限制的有效方法和途径；在此基础上，进一步研究流体流动、培养环境和操作参数对内皮细胞与成纤维细胞及胞外基质相互作用的影响，揭示并认识大型工程化组织方式调控微血管和毛细血管网形成及分布的机制与手段，建立细胞、胞外基质和血管化网均布以及过程参数易控的大型预血管化工程组织体外构建技术，为研制工程化组织体外构建生物反应器及其优化操作策略提供基础数据，并为未来大型预血管化组织工程产品的开发和临床应用奠定基础。

针对体外组织构建过程中存在的传质限制问题，基于前期建立的工程化组织体外构建的“微构重塑技术”，模拟体内天然组织结构和所处的微环境，通过认识构建过程中流体流动、培养环境和操作参数对组织构建的影响及规律，理解细胞与细胞、细胞与培养环境中关键成分的相互作用，以实现体外构建细胞及胞外基质均布的具多通道工程化组织和预血管化工程组织。.研究结果表明，基于组织微构重塑技术体外可构建特定形状的工程化组织。模拟体内血管网络，在体外成功构建了细胞密度高、活性好、细胞与胞外基质均布的多通道工程化组织。在构建过程中，提高培养基灌注速率，有效改善支架内部流体流动，刺激成纤维细胞生长和胶原基质合成，但增加了流体剪切力和胶原流失的比例。合适的微组织堆积密度有利于形成结构、活性均良好的构建物。将灌注培养时间延长至2周，形成的厘米级骨组织具更高的细胞密度、代谢活性和成骨特性；植入动物皮下后，移植物中有更多的血管迁入和骨基质沉积。因此，基于组织微构重塑技术，通过流体流动控制、培养环境改善及操作参数调控，可以构建细胞密度高、细胞活性好、细胞与胞外基质分布均匀的厘米级多通道工程化组织和厘米级工程化骨组织。.为了构建基于内皮细胞的预血管化工程组织，本项目建立了多种细胞二维和三维共培养体系，研究并认识了预血管化工程组织构建过程中关键因素的作用及机制。血管样结构是由成纤维细胞（HF）和内皮细胞（HUVEC）共同构成，合适HF和HUVEC比例、HF预贴附及分泌的细胞因子和胞外基质均能促进血管样结构的形成与稳定；调节与胞外基质合成和降解、内皮细胞增殖、壁细胞招募、成血管等相关基因的表达水平可调控血管样结构的形成过程。在三维培养体系中HF与HUVEC直接接触能显著促进HUVECs出芽，且HFs对HUVECs定向迁移和出芽具引导作用。基于微构重塑技术进一步构建预血管化的工程化骨组织，MSCs和HUVECs经细胞增殖及成骨诱导三维共培养所得的骨组织具有较高的细胞活性、成血管功能和成骨特性；在共培养过程中HUVECs影响MSCs成骨分化，且与MSCs所处的分化状态有关，在成骨诱导阶段接种HUVECs有利于MSCs的成骨分化。因此，基于微构重塑技术，通过MSCs和HUVECs三维共培养，可制备细胞活性高且具有成骨分化及成血管能力的内皮化骨组织，上述结果为进一步制备大型血管化骨组织及未来临床应用奠定基础。