新型干细胞膜片技术构建预血管化组织工程真皮的研究

The repair of dermal impairment plays an important role in inhibiting of scar formation and promoting the survival of graft, however, the dermal tissues used in clinic have a lot of drawbacks impacting on their healing effect. Two dimensional cell sheet is composed of its own cells and self-secreted cellular matrix, so they can overcome the shortcomings of exogenous materials, and are widely applied in tissue repair, nevertheless the lack of vascular supply can cause the constructed tissue death. In our previous studies, we creatively cultured vascular endothelial cells on the preformed stem cell sheet, and found that the prevascularized cell sheet would form, therefore the problems of vascularization can be effectively resolved. Herein, this study will attempt to prepare a temperature sensitive hydrogel culture system by biomimetic method as a detachment platform of cell sheets in order to solve the deficiency existing in traditional preparation method. Based this platform, the prevascularized cell sheets and dermoid cell sheets will be constructed. Meanwhile we will study the feasibility of the construction of three dimensional multifunctional tissue dermis by using new type of stem cell sheet technology, reveal the mechanisms of stem cell in the vascular form, fibroblastic proliferation, migration, and in promoting the wound healing. In addition, this study will explore a new strategy for construction of three dimensional tissue dermis, and provide a new way of treating and healing of skin wound.

真皮的修复在抑制瘢痕的形成，促进移植物成活方面起到重要的作用，但是目前构建的真皮存在许多不足，均达不到理想的修复效果。细胞膜片由自身细胞及其分泌的细胞外基质构成的二维组织，能克服外源性材料的不足，在组织修复得到广泛应用，然而其在构建立体真皮时，由于缺乏血管供给，导致构建的组织死亡。在前期工作中，我们原创性的在干细胞膜片的表面共培养血管内皮细胞，从而成功构建预血管化的细胞膜片，有望解决细胞膜片构建立体真皮遇到的血管化难题。因此，本研究拟通过生物仿生的方式构建温敏性水凝胶培养系统，解决传统制备方法存在的不足，以其作为新型的脱膜片平台，制备预血管化细胞膜片及预血管化真皮样膜片，探索采用新型干细胞膜片技术构建多功能性立体真皮的可行性，研究干细胞在血管形成中的作用机制，揭示干细胞对成纤维细胞的增殖、迁移的调控机制及促进伤口愈合的作用机制，以期探索构建立体真皮的新策略，为皮肤创面修复和愈合提供新思路。

真皮的修复在抑制瘢痕的形成，促进移植物成活方面起到重要的作用，但是目前构建的真皮存在许多不足，均达不到理想的修复效果。细胞膜片由自身细胞及其分泌的细胞外基质构成的二维组织，能克服外源性材料的不足，在组织修复得到广泛应用，然而其在构建立体真皮时，由于缺乏血管供给，导致构建的组织死亡。为了解决上述问题，本研究创新性采用生物仿生的方式构建了温敏性水凝胶培养系统，其具有明显的温敏特性和良好的生物相容性。在37℃，能够促进干细胞的粘附和生长，并促进细胞膜片的形成，当环境温度降到20℃时，完整的细胞膜片在40分钟内能够从培养皿的表面脱离，且细胞形态、膜片的厚度，相关蛋白的纤维结构与没有修饰的培养皿表面获得的膜片相似。在此培养系统上，我们通过共培养的方式成功制备了预血管化的骨髓间充质干细胞膜片和预血管化的成纤维细胞膜片，对制备的两种细胞膜片进行叠加或折叠，成功制备出3层和6层的预血管化的组织工程真皮。将其植入到真皮缺损的动物模型后，在14天内，3层组织工程真皮的伤口愈合率能够达到97.2%，远远高于对照组和其他实验组，在愈合组织内能够明显观察到新生血管的形成及新生真皮层的构建，最终促进新生表皮层的形成，达到理想的修复效果。除此之外，我们基于干细胞膜片技术构建了预血管化的神经导管，其具有类似于自体神经导管的功能，植入到脊神经缺损处后，能够促进新生血管的形成，有效解决脊神经修复中存在的缺血和缺氧问题。膜片中的干细胞在体内能够定向分化为神经元，参与缺损处的神经修复，有效解决了缺损处神经元无再生能力的难题。同时干细胞的引入能够有效抑制神经胶质细胞分泌的神经胶质酸性蛋白的形成，其被认为是阻碍神经愈合的一种不利因素。因此同其他组相比，预血管化神经导管能够有效促进脊神经缺损的修复，并于28天后，动物的后肢部分恢复了运动功能，神经导管的构建为构建具有神经、血管功能的真皮组织打下一定的基础。