溶藻弧菌NQR蛋白复合物耐药的研究

China has a great scale of marine aquaculture, which inevitably leads to occurrences of infectious disease and subsequently misuse of antibiotics. Thus, antibiotic-resistant bacteria are frequently isolated. The idea on the development of antibiotics to combat antibiotic-resistant pathogens is challenged due to the declining number of new antimicrobials in the developmental pipeline, long term for the development in contrast with short time for generation of resistant bacteria to the new drugs. Actually, use of new drugs is to select multidrug bacteria that resist more drugs than before, which leads to development of new antibiotic-resistant mechanisms. Thus, an alternative solution is extremely necessary based on an understanding of new antibiotic-resistant mechanisms. In the present project, based on the previous finding that Na+-NQR complex plays an important role in antibiotic resistance in Vibrio alginolyticus in combination of repots on proton motive force (PMF)-dependent uptake of aminoglycesides antibiotics, we plan to investigate drug-resistant spectrum, proteome, metabolome and molecular characteristics of Na+-NQR complex for an understanding of the molecular mechanism how the complex regulates content of PMF. We hope that a novel target for development of a new drug is provided for control of bacterial pathogens in marine culture.

我国为海水养殖大国，抗生素滥用严重，病原菌耐药情况严峻。既往依靠发明新抗生素控制耐药菌的策略越来越受到严峻挑战，因为新抗生素发现的周期较长且越来越难，而细菌对新抗生素的耐药性很快出现。新抗生素的使用实际上是在选择耐药谱更宽的多重耐药菌，使耐药机制发生了变化，直接挑战现今使用的新抗生素。因此，更新思路加强新耐药机制的研究势在必行。本项目基于前期发现耐药溶藻弧菌Na+-NQR复合物下调以发挥耐药作用的基础上，结合提高提高质子动力势(PMF)可以促进抗生素杀菌的相关报道，拟系统开展海水养殖重要病原性溶藻弧菌Na+-NQR蛋白复合物耐药谱、蛋白质组、代谢组和分子特征的研究。旨在揭示耐药菌通过负调Na+-NQR复合物以调控其PMF，减少抗生素进入，实现耐药的分子机制, 为控制海水养殖耐药菌新药研制提供高效靶点。

溶藻弧菌抗生素耐药性对人和水产养殖是极大的威胁。该项目主要进行了3方面研究：. 溶藻弧菌Na+-NQR复合物通过调控PMF耐受抗生素的作用机制:环境中NaCl浓度调节铜藻弧菌生理特征已有报道，但是NaCl浓度是否调节细菌对抗生素抗性还不知道。该研究首先测定了溶藻弧菌在不同NaCl浓度中对抗生素抗性，结果发现随着NaCl浓度升高，溶藻弧菌的抗生素抗性增加，尤其是氨基糖苷类抗生素增加最为显著。接着，测定了溶藻弧菌胞内NaCl浓度和庆大霉素梯度，发现随着NaCl浓度升高，进入到胞内的NaCl增多，庆大霉素含量却降低。进一步采用基于GC–MS的代谢组学研究，发现丙酮酸循环的中间代谢物丰度在0.5%, 4% 和10% NaCl下表现出不同的表现。P循环中酶活性的不同和NQR复合物中亚基的不同表达使溶藻弧菌氧化状态降低，导致NADH，PMF和ATP都下降。同时，氧化状态降低致使NaCl负调PMF。这些结果致使NaCl浓度增加而胞内庆大霉素浓度下降。该研究揭示了以前未知的氧化状态依赖的NaCl调节抗生素抗性机制。. PMF作用外的其他机制：NQR复合物作为钠泵通过调节膜电位在氨基糖苷类抗生素抗性中起重要作用，是否还有其他机制不清楚。该研究首先构建了NQR复合物2个关键亚基基因nqrA 和 nqrF缺失菌株体，缺失后对氨基糖苷类抗生素、氯霉素类抗生素、头孢类抗生素和多肽类抗生素抗性增加。然后采用基于GC-MS代谢组学对ΔnqrA和ΔnqrF代谢组研究，鉴定出下调的丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢为影响最大的代谢通路，降低的丙氨酸为最关键的分子标志物。基因nqrA 和 nqrF缺失后，溶藻弧菌对庆大霉素的抗性增加，外源丙氨酸可逆转该抗性。上述研究表明NQR复合物通过代谢调节抗生素抗性这个新的机制。. 中心能量代谢下降是细菌耐药重要特征：采用iTRAQ分析了溶藻弧菌左氧氟沙星耐药菌，得到了160个差异表达蛋白，其中70个表达下降，90个表达上升。通过iPath分析、qRT-PCR、膜电位和能荷比检测，表明降低的中心碳代谢和能量代谢是溶藻弧菌左氧氟沙星耐药性适应性的典型特征。