弧菌和迟钝爱德华菌DNA改组多价疫苗及其分子机制

E. tarda and Vibrio have caused great losses in marine aquaculture. Although vaccines are very efficient in preventing hosts from pathogen's infections, their role in protecting aquaculture improvement is limited since it is impossible fish to be immunized by every pathogen based on economic balance and clinic use. Therefore, development of cross-protective vaccines and antisera that can fight against as many pathogens as possible is in an urgent need. A line of evidences has demonstrated that OmpA, an outer membrane protein distributed in almost of Gram-negative bacteria, is a type of good immune protective immunogen. Our results have showed that the proteins that origin from Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, Edwardsiealla tarda, Escherichia coli also show a cross-protective reactivity against different bacterial infections. However, the cross-protective ability is not satisfied for the need of controlling the infections caused by not only E. tarda and but also Vibrio. In the present project, OmpA genes from V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, Edwardsiealla tarda, Escherichia coli is used as original materials for DAN shuffling since bacterial OmpA shows immune protective role and high homology. The DNA shuffling aims to obtain a directed evolution OmpA gene that has more efficient immune protection and cross-protective ability. Furthermore, a point mutation technology is used to investigate changes in key sequences for understand the molecular mechanism of a polyvalent immunogen. The project based on these systematic studies will develop a polyvalent gene efficiently against infections caused by E. tarda and Vibrio and clarify its molecular mechanism.

目前，迟缓爱德华菌和弧菌严重危害我国海水养殖业。无论从经济还是从实际使用情况来考虑，很难对每种常见病原菌逐一进行免疫。因此，研究跨种属多价疫苗成为鱼类疫苗发展的重要方面。OmpA高度保守，普遍存在于革兰阴性菌表面。研究表明，OmpA是同种细菌感染的良好保护原。我们发现，溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华菌和大肠杆菌来源的OmpA还是一种较好的跨细菌种属的交叉保护原，但交叉保护作用尚不能满足同时控制迟缓爱德华菌和弧菌的需要。项目依据OmpA基因具有明显保护效果和其同源性较高的特点，以溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华菌和大肠杆菌OmpA为起始基因，采用DNA改组技术，筛选保护效率更高、交叉中和作用更强的OmpA定向进化产物。同时，采用点突变技术研究多价保护的分子机制。通过这些系统的研究，旨在发明一种能够高效交叉保护主要海水养殖动物病原性弧菌和迟缓德华菌的多价疫苗靶基因，并阐明其交叉分子保护机制。

细菌性病害严重危害水产养殖业，采用疫苗和抗生素进行防治是最主要的2种方式。由于抗生素的大量使用不但导致耐药菌的产生而且影响食品安全，所以通过疫苗进行免疫预防更受到高度重视。然而，集约化养殖水体环境较差以及病原菌种类较多，需要对多种病原菌感染进行疫苗防治。我国养殖鱼类个体偏小，从经济效率和实际操作来考虑，也难以对常见病原菌逐一进行疫苗免疫。因此，研究多价疫苗具有重要意义。. DNA改组技术可以在分子水平上对基因进行体外有性重组，由此改变单个基因或基因家族原有的核苷酸序列，创造新基因并赋予表达产物新功能，推动了生物工程的诸多领域突飞猛进地向前发展。本研究探讨采用DNA改组技术，获得多价保护原的可行性，继而对其分子机制进行研究。.目前我国海水养殖动物病原菌主要为弧菌和迟缓爱德华菌，故本论文以6种OmpA基因（E.coli ompA、ETAE_1267、VP0764、VPA186、VA0764、vpa1186）为改组对象，研制针对弧菌和迟缓爱德华菌感染的多价保护原。为此构建了4个嵌合体改组基因文库。在此基础上，构建改组基因的真核表达质粒（即改组DNA疫苗），以斑马鱼为动物模型，进行了免疫保护评价。在文库OmpAs-FV中获得3个免疫保护率达90%以上的高保护原基因（1号、78号、83号）；并根据针对弧菌感染的免疫保护率将改组DNA疫苗分为高（>86 %）、中（52%-60%）和低（< 15%）保护作用3种类型。在文库OmpAs-SV中筛选得到1个交叉感染时保护率达80%以上的候选疫苗基因（19号）。在文库OmpAs-SE中筛选到4个交叉感染时保护率达90%以上的候选疫苗基因（改组基因编号为17、24、44、58）。文库OmpAs-FE中筛选到4个针对弧菌和迟钝爱德华氏菌感染保护率达80%以上的多价疫苗基因（编号为7、16、17、48）。. 各类型随机各取10个改组基因进行测序，发现基因核苷酸序列改变规律与免疫保护率密切相关。. 综上所述， 本研究的结果说明DNA改组技术可用于创造高效多价候选疫苗，提高水产疫苗的保护原性。同时，从分子水平上分析免疫保护原性与核苷酸序列以及氨基酸变化的关系，也为制备高效疫苗提供相关理论依据。