溶藻弧菌毒力蛋白的鉴定及功能研究

本项目拟采用荧光差异双向凝胶电泳（2-D DIGE）、质谱鉴定和生物信息学等技术，对溶藻弧菌强毒株和无毒株的全菌和胞外蛋白进行比较分析，以期鉴定5-8个毒力相关蛋白；进而用分子生物学手段克隆2-3个关键毒力蛋白基因并进行原核生物表达，利用重组蛋白进行体外和鱼体内毒性试验，评价各毒力蛋白基因表达产物对红笛鲷毒性的差异；利用实时定量RT-PCR法研究培养条件对毒力蛋白基因表达的影响；用绿色荧光蛋白GFP 报告基因构建毒力蛋白基因的重组质粒，并将其转染红笛鲷，观察融合蛋白的在鱼体内的分布情况，为揭示溶藻弧菌的致病机理奠定基础。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）广泛分布于各种水体中，是我国水产养殖动物弧菌病的致病菌之一，给水产养殖业带来巨大损失，引起研究人员的密切关注。本研究以溶藻弧菌强毒株HY9901和弱毒株ZJ12为研究对象，通过为期三年的研究，项目组完成了以下内容：1）通过荧光差异双向电泳技术，成功地对溶藻弧菌强、弱毒株进行分析，质谱鉴定了其中的68个强毒株特有的蛋白质点，获得了66个ORF。2）应用LC-MALDI，对溶藻弧菌强毒株HY9901和无毒株HY12胞外产物进行比较分析，获得强毒株HY9901特有的不同于HY12的蛋白共有175种。3）项目组选择15个毒力相关基因进行克隆和序列分析，获得密度感应基因luxR、荚膜多糖合成蛋白cpsB、荚膜多糖合成蛋白cpsD、摄铁基因exbB、不依赖tonB的摄铁相关基因tolB、鞭毛蛋白基因flgL、血晶素结合蛋白hutB、外膜蛋白ompH基因的开放阅读框（open reading frame，ORF），并对它们进行了全面的生物信息学分析。此外得到7个毒力相关基因的片段，它们是呋喃糖基硼酸二酯（密度感应基因）luxS，鞭毛蛋白基因flaE，鞭毛蛋白基因flg，外膜蛋白yscO，溶血素tlh，外膜蛋白yscC，毒素dtd。4）运用荧光定量PCR观察毒力基因在溶藻弧菌强毒株和弱毒株中的表达情况，发现鞭毛蛋白基因flaE、flgL和flgI，毒素基因tlh，dtd，血晶素结合蛋白hutB，摄铁系统相关基因exbB，tolB，与溶藻弧菌的毒力呈相关性。5）此外对tolB和vscO基因进行了原核表达。6）研究了vscO在不同培养条件下的表达情况，发现在温度为28 ℃，盐度为2%以及培养基起始pH为7.0时，vscO的表达量最大。而在其他条件下，vscO的表达量则很低。7）通过半致死浓度试验测定VscO蛋白对溶藻弧菌的致病力，结果发现：溶藻弧菌野生株LD50为2.23×105 cfu， vscO基因缺失株LD50 为1.99×106 cfu/fish，vscO的缺失使野生型溶藻弧菌的毒力下降约一个数量级。 8）用绿色荧光蛋白GFP 报告基因构建了HY9901-GFP，但将其转染红笛鲷，未能观察到融合蛋白的分布情况。9）通过整合以上研究成果，与弧菌致病机制的已有认识进行对比分析，为溶藻弧菌的分子致病机理提供了新的理论和技术支撑。.