凡纳滨对虾防御溶藻弧菌感染的免疫应答相关蛋白的研究

In order to overcome the loss of shrimp culture caused by vibrio disease, the project make an exhaustive study of molecular mechanisms of immune response in Litopenaeus vannamei by the view of Vibrio alginolyticus stress. Firstly differentially expressed proteins in hepatopancreas of the shrimp which under V.alginolyticus stress are identified and screened with the help of two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. To identify the condition of early infection and key metabolic pathways of L. vannamei suffered V.alginolyticus, we clone new key genes in the shrimp and analyse the protein expression, tissue localization, biochemical and cytological effect, then explore the regulation and function patter of shrimp towards Vibrio stress by the application of RNA interference (dsRNAi) and GST-pull down molecular technology. In practical applications, we will efficiently express the recombinant protein as aquaculture feed which can highly improve the shrimp immunity system, to expect to improve the shrimp disease resistance, replace the abuse of antibiotics and drugs and provide a new solution for the prevention and control of bacterial diseases of shrimp.

为了减少弧菌病害给虾类养殖造成的损失，本项目选择从溶藻弧菌胁迫的角度切入，深入研究凡纳滨对虾对溶藻弧菌感染的免疫应答分子机制。我们首先利用双向电泳和质谱技术鉴定和筛选溶藻弧菌胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺中差异表达的蛋白质。在此基础上，对新的关键响应蛋白进行基因克隆，分析其蛋白表达，组织定位，生化活性和细胞学作用，进而运用RNA干扰（dsRNAi）和GST-pull down等分子技术研究其对弧菌胁迫的调控作用与功能，以期识别凡纳滨对虾遭受弧菌感染后早期的发病情况和关键的代谢途径，为鉴定何种细胞传导途径在弧菌感染后受到影响提供新的线索。在实际应用方面，我们将利用毕赤酵母表达体系高效表达能够提高凡纳滨对虾免疫力的重组蛋白，用于水产饲料，以期提高虾类抗病能力，取代抗生素及药物的滥用，为对虾细菌性疾病的防控提供新的解决途径。

溶藻弧菌是对虾养殖的主要致病菌之一。本项目从溶藻弧菌胁迫的角度切入，深入研究了凡纳滨对虾对溶藻弧菌感染的免疫应答分子机制。通过双向电泳和质谱技术，项目组鉴定和筛选了藻弧菌胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺中差异表达的蛋白质，相继克隆了14个重要的免疫基因（分别包括DJ-1、Rac1、Galectin、Cdc42、P5CDh、PTEN、Rho、Ras、Rab、GRIM-19、PHB2、PI3K、MST4和Rad23基因），研究了各基因在对虾体内的组织表达情况以及对溶藻弧菌应激的响应特征，分析了它们在溶藻弧菌感染过程中的重要作用。在此基础上，分别利用RNA干扰、GST-pull down和基因过表达等技术，探讨了部分基因参与的信号途径在对虾防御溶藻弧菌感染过程中的变化，初步勾勒出MAPK途径、PI3K/Akt途径、JAK / STAT途径和p53途径在凡纳滨对虾响应溶藻弧菌感染的作用方式。在应用方面，有针对性的利用毕赤酵母表达体系高效表达了DJ-1、Rac1和Galectin的重组蛋白。其中，重组蛋白rLvgalectin对革兰氏阴性菌抗菌效果显著，为进一步研究开发新型的抗病对虾饲料添加剂提供了技术支撑。上述部分内容已在Developmental and Comparative Immunology（6篇），Fish & Shellfish Immunology（5篇），Aquatic Toxicology（1篇）等水产国际刊物上发表论文20篇，授权国家发明专利1项。项目的完成拓展了人们对凡纳滨对虾抗逆机制的理解，为阐明凡纳滨对虾对溶藻弧菌感染的免疫应答分子机制提供了重要数据。