迟缓爱德华氏菌宿主整合因子调节TolC耐药外排泵的研究

Antibiotic-resistant pathogens pose a big challenge to aquacutral industry. Among the antibiotic-resistant mechanisms, TolC efflux pump has been paid attention to since it plays a crucial role in the resistance, and thus regulation of the pump should be furter explored. Based on the previous findings that Edwardsiella tarda integration host factor β (IHFβ) binds antibiotics which regulates the tolC promoter, and affacts pyruvate metabolism, the present propposal investigates E. tarda IHF regulates TolC efflux pump to mainly undestand response patterns of IHF to different classes of antibiotics, regulation of IHF-antibiotic complex to AcrAB-TolC and regulation of central carbon metabolism to AcrAB-TolC. Since information regarding to regulation of IHF to AcrAB-TolC is not available, investigation on regulation of IHF to TolC is original: 1) To disclose direct regulation of TolC at level of global regulator rather than two-component-system; 2) To disclose indirect regulation of AcrAB-TolC by metabolism at level of global regulator; 3) To understand a network regulation among antibiotics, IHF, TolC and AcrAB. These studies will reveall TolC regulation mechanism at a new view to provide a non-antibiotic target for design of new drugs.

细菌抗生素耐药严重危害水产养殖业，其耐药机制中TolC外排泵的作用十分重要被高度关注。本项目基于前期发现迟缓爱德华菌宿主整合因子β亚基（IHFβ）结合巴洛沙星及其复合物调节TolC启动子以及影响丙酮酸代谢通路的基础上，拟系统开展迟缓爱德华菌IHF调节TolC的研究。主要研究IHF对抗生素的应答规律，与抗生素复合物对AcrAB-TolC调控作用以及调节中心碳代谢对AcrAB-TolC调控作用。由于既往无IHF对耐药调节的报道，因而从IHF角度研究TolC的调控具有以下原创性：1）从全局调节因子水平，而不是限于双调节系统水平，揭示对TolC的直接调控机制；2）从全局代谢调节因子层次，阐明代谢对AcrAB-TolC的间接调控作用；3）深入认识抗生素、IHF、TolC和AcrAB的网络调节关系。这些研究将从一个崭新角度来揭示TolC的调节机制，可为控制水产养殖耐药菌提供非抗生素类新药靶点。

细菌抗生素耐药严重危害水产养殖业，其耐药机制中TolC外排泵的作用十分重要被高度关注。. 本项目采用蛋白质组学研究手段，通过对抗生素巴洛沙星应激迟缓爱德华菌后抗生素结合蛋白的研究，发现宿主整合因子为抗生素结合蛋白，揭示了抗生素作为细菌耐药发生起始因子的重要作用。进一步基于前期发现迟缓爱德华菌宿主整合因子β亚基（IHFβ）结合巴洛沙星及其复合物调节TolC启动子以及影响丙酮酸代谢通路的基础上，系统开展了迟缓爱德华菌IHF调节TolC的代谢研究。. 首先对外排泵基因对抗生素敏感性进行了研究，发现迟缓爱德华菌缺失AcrA/B-TolC外排泵基因后，对大多类抗生素的敏感性均提高。接着开展了迟缓爱德华菌acrA/B-tolC外排泵缺失菌对喹诺酮类、氨基糖苷类、青霉素类耐药的代谢调节。结果发现，3个缺失菌株胞内富集代谢通路代谢物全部升高的有嘌呤代谢，其代谢产物有腺苷、肌苷、腺嘌呤。同时，通过胞外代谢组学分析，发现腺苷、肌苷和腺嘌呤为共同下降代谢物。通过杀菌实验发现，外源腺苷与抗生素联用可以使起始菌株对抗生素的敏感性与缺失菌株包括tolC缺失菌株对单用抗生素的敏感性均相似。为了证实外源腺苷由于细胞内腺苷浓度的影响而增加细菌的敏感性，用外源腺苷重新编程分析起始细菌的代谢组，结果发现，外源腺苷可以提高起始菌胞内腺苷含量，其浓度可以达到与acrA/B缺失菌相似。这些结果支持上述结论：AcrA/B-TolC外排泵缺失导致外排腺苷能力下降是缺失菌对抗生素敏感性提高的一种新机制。. 总之，本研究采用蛋白质组学和代谢组学的研究方法，发现宿主整合因子为抗生素结合蛋白，揭示了抗生素作为细菌耐药发生起始因子的重要作用。揭示了AcrA/B-TolC外排泵抗生素耐药调节的一种新机制，为防治耐药菌提供了新的思路。