鞘糖脂全面表征分析新技术及其在肺癌生物标志物研究中的应用

Glycosphingolipids, which consist of ceramide and glycan moieties, are a kind of glycolipid complexes. The abnormal expression of glycosphingolipids has been proved to play key roles in the development of lung cancer. However, the detection of glycosphingolipids is difficult and has long been ignored by metabolomics research because of their high complexity and large molecular weight (most larger than 1000 Da). The bottlenecks of current analytical methods have severely restricted the biological function elucidation of glycosphingolipids. In this project, a new technique will be developed for the rapid identification and comprehensive characterization of glycosphingolipids in biological samples. Non-enzymatic release of glycosphingolipid oligosaccharide chains will be achieved through ozone mediation. The released oligosaccharides will be comprehensively identified based on pre-columnar derivatization and glycomics analysis. The chemical structures of all theoretical glycosphingolipids can be obtained by combining the identified oligosaccharide chains and ceramide structures from the network database. Mathematical model of quantitative structure-retention relationship will also be established to predict the retention times of all theoretically possible glycosphingolipids. Finally, a database, consisting the information of chemical structure, m/z value and predicted retention time of more than 3000 theoretically existed glycosphingolipids, will be created for the rapid identification of glycosphingolipids in biological samples. Based on this new glycosphingolipid analysis technique, a clinical cohort study will carry out to seek sensitive and accurate lung cancer biomarkers. Blood biomarkers will be investigated for diagnosis and prognosis of lung cancer, aiming to provide more accurate methods for clinical diagnosis and treatment of lung cancer.

鞘糖脂是一类由神经酰胺和寡糖链组成的糖脂复合物，其异常表达与肺癌的进展密切相关。但是由于其结构的复杂性和多样性，且分子量多大于1000Da，鞘糖脂的检测难度大，长久以来被代谢组学研究所忽略，严重制约了其生理功能的深入阐明。本课题首次聚焦于鞘糖脂全覆盖分析技术的研究，通过臭氧介导实现鞘糖脂寡糖链的非酶释放，进一步基于柱前衍生化和糖组学分析技术，对鞘糖脂的寡糖链进行全面鉴定，结合网络数据库中的神经酰胺结构，组合得到所有理论鞘糖脂的化学结构。此外，本课题拟构建基于化学结构的鞘糖脂保留时间预测模型，实现理论鞘糖脂保留时间的准确预测。最终建立包含3000种以上鞘糖脂化学结构、保留时间和高分辨质量数信息的化合物库，用于样本中鞘糖脂的快速识别和全面表征分析。在此基础上，将鞘糖脂分析新技术用于肺癌临床队列研究，寻找可以用于肺癌诊断和预后评估的特异性鞘糖脂生物标志物，为肺癌的临床诊疗提供更精准的方法和依据。

本课题聚焦于鞘糖脂全覆盖分析技术的研究。首先优化了生物样本中鞘糖脂的提取方法，最终从提取效率和溶剂环保性角度综合评估，确定甲基叔丁基醚/甲醇/水体系（MTBE法）为最终的生物样本中鞘糖脂的提取方法。之后，本研究采用鞘糖脂混合对照品进行了液相条件和质谱条件的优化，最终建立了高效和高灵敏度的鞘糖脂分析方法。..基于所建立的超高效液相高分辨质谱（UHPLC-HRMS/MS）分析方法，对鞘糖脂混合对照品进行分析。通过采集商品化混合对照品的UHPLC-HRMS/MS数据，结合一级高分辨质量数和二级高分辨碎片离子的解析，在混合对照品中一共鉴定到968个鞘糖脂化合物。通过混合对照品中鞘糖脂化合物的化学结构和保留时间的规律，构建了鞘糖脂的保留时间预测模型，最终建立了包含4000余种鞘糖脂的化合物库，库中包含各种鞘糖脂的化学结构、保留时间和高分辨质量数等信息。所建立的鞘糖脂化合物库可以很好的用于生物样本中鞘糖脂的快速识别和全面表征分析。..基于所建立的鞘糖脂全面表征分析新技术，进行肺癌临床队列研究，寻找可以用于肺癌诊断和预后评估的血液生物标志物。此外，本研究还收集了所有受试者的临床病例信息，包括患者的病理分型、肿瘤分期、肿瘤标志物和基因突变（EGFR、KRAS、ALK和ROS1）等信息。基于健康志愿者和肺癌患者血清鞘糖脂含量进行统计分析，完成肺癌诊断生物标志物的遴选。进一步，以肺癌的病理分型为分层依据，探索小细胞肺癌、肺鳞癌和肺腺癌在鞘糖脂水平的差异。最后，通过ROC分析，将遴选出来的鞘糖脂生物标志物与传统的肺癌生物标志物癌胚抗原、鳞状上皮细胞癌抗原、CA19-9、细胞角蛋白19片段、CA125和神经元特异性烯醇化酶进行灵敏度和特异性的对比，本研究所发现的潜在生物标志物具有更好的灵敏度和特异性。..项目的实施成功建立了鞘糖脂快速识别和全面表征分析新技术，发现高灵敏和特异性的肺癌临床诊疗潜在生物标志物，为肺癌的早期筛查估提供新的依据。