鞘糖脂在小菜蛾对Bt抗性中的作用及分子机制研究

Bt is a kind of environment friendly microbial pesticides, widely applied throughout the world, however, the rising of pesticide resistance to Bt is seriously threatening the service life of Bt crop. Plutella xylostella is one of the most serious Bt resistant pests, in order to expound the mechanism of insect resistance to Bt toxins, solve the problem of pesticide resistance fundamentally, this project plans to clone 5 glycosyltransferase genes involved in the biosynthesis of glycolipids and analyze gene mutations in resistant strain of Plutella xylostella, establish RNA interference system and determine the reaction characteristics of Plutella xylostella to Cry1Ac after gene silencing, extract glycolipids in midgut of Plutella xylostella and determine its affinity for Cry1Ac, separate glycolipids using thin layer chromatography and quantitatively analyze the difference of its components between resistant and susceptible strains of Plutella xylostella, compare combination properties of various glycolipids components and Cry1Ac using the method of Blot Overlay, establish a Plutella xylostella population whose route for synthesis of glycolipids is blocked by glycosyltransferase inhibitors NB-DNJ, determine toxicity of Cry1Ac to this population. Above all, a variety of techniques will be utilized comprehensively for evaluating the role of glycosyltransferase in Bt toxicity and insect resistance mechanism.

Bt是一种环境友好型微生物杀虫剂，在世界范围内得到广泛应用，但害虫对Bt抗药性上升正严重威胁着转Bt基因作物的使用寿命。小菜蛾是抗药性最为严重的害虫之一，为阐明其对Bt毒素产生抗性的机制，从根本上解决抗药性问题，本项目拟克隆5个鞘糖脂合成所需酶基因；分析各基因在抗敏品系小菜蛾中的差异位点；分别建立各基因的RNA干扰体系，测定基因沉默后小菜蛾对Bt毒素的反应特性；提小菜蛾中肠糖脂，测定Cry1Ac与糖脂的亲合力；薄层层析板上分离糖脂，并进行定量分析，比较各组分在抗敏小菜蛾中的差异；Blot Overlay法杂交Cry1Ac与鞘糖脂，比较抗敏种群小菜蛾鞘糖脂各组分与Cry1Ac的结合特性；建立鞘糖脂合成路径被糖基转移酶抑制剂NB-DNJ阻断的小菜蛾种群，测定Cry1Ac对该种群小菜蛾的毒力。综合利用多种技术，从不同的角度，平行测定评价鞘糖脂在小菜蛾对Bt抗性中的作用及分子机制。

苏云金杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)内毒素是一种杀虫特异性高、对脊椎动物安全的杀虫蛋白，是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，在世界范围内得到广泛的应用。由于其长期使用，已经在部分地区发现了小菜蛾对Bt制剂产生了严重抗性，目前转Bt基因农作物和Bt制剂的使用正面临着害虫对Bt抗药性的威胁。小菜蛾(Plutella xylostella )的生殖周期短、繁殖量大、适应性广，是世界性分布的重要农业害虫，也是产生抗药性最严重的害虫之一。为阐明其对Bt 毒素产生抗性的机制，从根本上解决抗药性问题，本项目建立鞘糖脂合成路径被糖基转移酶抑制剂NB-DNJ 阻断的小菜蛾种群，使得糖脂合成量降低了62%；测定Cry1Ac 对抗性、敏感和糖脂合成路径被阻断的小菜蛾种群的毒力，结果显示Cry1Ac对对抗性、敏感和糖脂合成路径被阻断的小菜蛾的致死率分别达到8%、93%、46%；克隆了糖脂合成必须的糖基转移酶基因bre1、bre3、bre4和bre5，并建立了bre3的RNA干扰体系，测定了基因沉默后小菜蛾对Bt 毒素的反应特性，结果显示，bre3基因沉默72小时后，小菜蛾对Cry1Ac的抗性水平明显提高；本项目综合利用多种技术，从不同的角度，平行测定评价鞘糖脂在小菜蛾对Bt 抗性中的作用及分子机制，为阐明Bt 杀虫蛋白对小菜蛾的分子毒理机制和小菜蛾对Bt 杀虫蛋白的抗性分子机制提供多重理论依据，研究结果对转Bt 基因植物／Bt 制剂的抗药性治理、新型Bt 杀虫蛋白的筛选以及延缓，甚至克服小菜蛾对Bt 毒素的抗药性、提高作物产量和品质具有重要的理论和实践意义。