调节性T细胞TRAIL信号通路在SAA患者CTL功能亢进中作用的研究

Severe aplastic anemia (SAA) is a rare immune-regulated disease characterized by severe pancytopenia and bone marrow failure, caused by destruction of hematopoietic cells by the activated T lymphocytes. Our previous studies have shown that dysfunction of regulatory T cells (Treg) in SAA patients might be an important reason for abnormal immune tolerance and the attacking of cytotoxic T cells (CTL) to their own hematopoietic cells. However, the specific mechanism remain unclear. In recent years, our research group have been mainly engaged in studying the role of Treg in SAA. It was confirmed that the expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) in Treg cells of SAA patients was abnormal, which was related to CTL hyperfunction and disease progression. Based on the preliminary work, we are going to use flow cytometry, RT-PCR, Western and some other methods to detect the TRAIL signal pathway and analyze its correlation with immune function of CTL in Treg cells of SAA patients. Meanwhile, we will explore the effect of changing TRAIL expression in Treg cells on the regulation of CTL function via cell culture in vitro. Further more, we will explore the effect of interfering TRAIL signaling pathway in Treg cells on CTL immune function and disease progression in SAA mouse model. The mechanism of SAA immune pathogenesis will be further clarified by above studies, which will provide further theoretical basis for development of immunotherapy of Treg cells.

重型再生障碍性贫血（SAA）发病与免疫异常密切相关。我们既往研究显示SAA患者调节性T细胞（Treg）功能缺陷，可能是导致免疫耐受机制异常，细胞毒性T细胞（CTL）攻击自身造血细胞的重要原因，但具体作用机制尚未明确。申请人近年来主要从事Treg在SAA中作用的研究，证实SAA患者Treg细胞肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）表达存在异常，与CTL功能亢进及疾病进展相关。本次课题拟在前期工作基础上，采用流式细胞术、RT-PCR、Western等方法对SAA患者体内Treg细胞TRAIL信号通路及其与CTL免疫状态相关性进行分析；建立细胞模型探讨改变TRAIL表达对Treg细胞调控CTL功能的影响；并建立SAA小鼠模型，阐明干扰Treg细胞TRAIL信号通路对SAA小鼠CTL免疫功能及疾病进展的影响。通过上述研究进一步明晰SAA免疫发病机制，为开辟基于Treg细胞的免疫治疗提供依据。

重型再生障碍性贫血（SAA）是一组血液系统重症，特点为全血细胞重度减少和骨髓造血功能衰竭。近年来研究表明，髓样树突状细胞数量(mDC)增多、功能亢进，引起Th1细胞比例升高，I型淋巴因子(IL-2、IFN-γ)分泌增多，引起细胞毒性T细胞（CTL）功能亢进，从而导致造血功能衰竭，但具体作用机制尚未明确。TRAIL是TNF家族细胞因子的一员，在细胞中表达至少一种特定的死亡受体DR4(TRAIL-R1)或DR5(TRAIL-R2)，可以诱导细胞凋亡。本课题组前期研究已证实SAA患者Treg细胞肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）表达存在异常，SAA患者CTL细胞TRAIL表达水平显著减低，而SAA患者CTL细胞上TRAIL受体的表达水平与正常对照没有明显差异。同时，我们发现SAA患者CTL细胞内TRAIL mRNA的表达与正常人没有差异，提示CTL细胞TRAIL的减低为外源性结合减低，而非内源性。本研究借助分子生物学、细胞培养及动物模型等技术，在体外细胞实验及SAA动物模型体内实验观察TRAIL对CD8+T细胞功能的影响，并对其发生机制进行分析。成功建立免疫介导SAA小鼠模型。与SAA模型组相比，TRAIL治疗SAA小鼠组外周血细胞及骨髓细胞数均有明显升高，TRAIL治疗SAA小鼠组血浆中IL-2、IL-12、TNF-a、IFN-γ水平较SAA模型组减低，提示重组小鼠TRAIL因子可以减轻SAA小鼠的炎症反应程度，且对再障小鼠的血象和骨髓象恢复有一定的治疗作用。细胞培养实验结果表明TRAIL因子可在体外下调SAA小鼠骨髓中CD8+T细胞表面CD25的表达，从而可能对CD8+T细胞功能亢进具有抑制作用，而TRAIL对于SAA小鼠骨髓中CD8+T细胞的凋亡水平并无明显影响。本研究还以SAA患者为研究对象，重组人TRAIL因子在体外可下调SAA患者CD8+T淋巴细胞的ZAP-70分子磷酸化水平，抑制CD8+T淋巴细胞活化，减低其功能活化分子CD69，HLA-DR，CD25的表达水平，从而减少其分泌穿孔素，颗粒酶，IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-12水平。总之，本研究明确了TRAIL对CD8+T细胞功能的影响及相关机制，进一步完善了SAA的免疫发病机制，并且提示了重组TRAIL很可能是治疗SAA的一种富有前景的新药物，并为此新疗法提供了一定的理论基础。