Notch1信号通路在HBx致肝细胞恶性转化中的作用及机制研究

乙肝病毒x(HBx)可通过反式活化作用激活一系列信号通路调控细胞增殖与凋亡、抑制DNA修复等参与肝癌发生机制，Notch信号通路在细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤发生中起关键作用。在前期HBx转基因细胞证实HBx致肝细胞恶性转化及发现HBx对宿主基因如DNA修复酶等表达的调控作用基础上，本项目拟深入研究HBx基因转染后对L02细胞Notch信号通路分子Notch1、NICD和Jagged1的影响；着重观察RNA干扰(RNAi)阻断Notch1信号通路后L02/HBx的细胞生物学特性及相关的细胞周期与凋亡调控基因表达的改变；并应用电泳迁移率变动分析法研究Notch1和另一重要信号通路NF-κB 间的串话作用及其与HBx致肝细胞恶性转化的关系。旨在从Notch1信号通路这一新的角度探讨HBx致肝细胞恶性转化的分子机制，可望为建立新的乙肝相关性肝癌治疗模式-肿瘤信号传导干预治疗提供实验基础和理论依据。

乙肝病毒X蛋白（HBx）在肝细胞癌（HCC）的发生过程中起重要作用，可通过多种途径和方式参与HCC的发生和发展，其中通过结合不同的信号分子激活相应的信号通路干扰细胞周期的正常调控是最重要的机制之一。Notch信号通路是一条高度保守的信号通路，通过影响细胞的增殖、凋亡及干细胞的更新、分化等在多种组织和细胞的发育中起关键作用。但其在HBx致HCC中的作用国内外鲜有报道。本课题通过实时定量RT-PCR 和Western Blot检测发现前期构建的稳定转染HBx的L02/HBx细胞与对照组相比，Notch1信号通路成员包括配体Jagged-1、受体Notch-1的胞内段NICD及靶基因Hes-1的表达均显著增高，提示HBx可活化Notch1信号通路。免疫共沉淀（IP）证实HBx与Notch1信号通路的作用方式可能为HBx直接或间接与NICD结合。然后采用RNAi技术成功构建了针对Notch1信号通路起稳定干扰效应的L02/HBx-shRNA1细胞株，发现Notch1信号通路干扰后细胞增殖减慢，细胞周期进程减缓，细胞凋亡增多；进一步采用实时定量RT-PCR 及Western Blot发现其细胞周期正向调控因子CyclinD1、CyclinE、CDK4、E2F1表达下调，负向调控因子p16、p21及pRb表达上调，细胞凋亡促进因子caspase-3、caspase-9表达升高，抑制因子Bcl-2表达降低；电泳迁移率变动分析法（EMSA）检测发现L02/HBx-Notch1 shRNA1细胞中NF-κB 结合能力降低，提示Notch1与NF-κB信号通路之间可能存在串话作用。总之，本课题研究发现HBx可能通过结合Notch1的胞内段NICD而激活Notch1信号通路，进而调控细胞周期及凋亡调控因子的表达而参与肝细胞的恶性转化，在此过程中可能存在Notch1与NF-κB信号通路之间的串话。这些结果从Notch /Jagged信号通路这一新的角度进一步完善了HBx致肝细胞恶性转化及癌变发生机制，同时建立了针对Notch1信号通路的RNAi干扰技术，为开创新的乙肝相关性肝癌治疗模式—肿瘤信号传导干预治疗提供了实验基础和理论依据；也为将来进一步从信号通路网络间串化及肿瘤干细胞等方面深入研究Notch信号通路在HBx致肝细胞癌发生机制中的作用提供了线索。