类速激肽信号系统在斜纹夜蛾生殖行为调控中的功能及调控机制研究

Tachykinin-related peptides (TRPs) and their receptors (TRPRs, a class of G protein-coupled receptor) play an important role in the regulation of reproductive behavior of insects, but their regulatory mechanisms remain to be clarified. In the present project, therefore, we aimed to: (1) clone two TRPs and two TRPRs (they have been shown to exist in Spodoptera litura in our previous work) in the tobacco cutworm Spodoptera litura; (2) clarify the functions of TRPs and TRPRs on female reproductive behavior regulation (including egg production, calling, response to male’s courtship and the production and releasing of sex pheromone, etc.) and male reproductive behavior regulation (including courtship, response to female’s sex pheromone, sperm activities and sperm competition, etc.), by using molecular biology, physiological and behavioral analysis; and (3) reveal the regulatory mechanism of TRPs and TRPRs on male and female reproductive behavior, respectively, by studying of the expression and distribution of TRPs and TRPRs，signal transduction of TRPRs and gene expression in reproductive system. This study not only will conducive to understand the molecular mechanism of insect reproduction and the differential evolution of gene function between the sexes, but also will provide ideas and target genes for pest control.

类速激肽（TRPs）及其受体（TRPRs，一类典型的G蛋白偶联受体）在昆虫生殖行为调控中具有重要地位，然而其具体功能和调控机制仍有待明确。本项目拟通过克隆前期工作中发现的斜纹夜蛾2个TRPs与2个TRPRs的基因, 并利用RNAi以及生理和行为学等手段，详细阐明它们在斜纹夜蛾雌性生殖行为（卵形成、排卵、对雄性求爱的反应、召唤行为以及性信息素的合成与释放等）和雄性生殖行为（求偶、对性信息素的反应、精子活性与精子竞争等）调控中的功能；进一步通过TRPs和TRPRs在雌雄生殖系统中的表达和分布、配体-受体体外表达、受体信号转导及其所引起的基因表达调节、以及表达调节在雌雄间的差异等分析，最终阐明类速激肽信号系统调控斜纹夜蛾雌雄两性生殖行为的分子机制。本研究有助于揭示昆虫生殖调节的分子机理以及基因功能在雌雄两性间的差异进化问题，并为基于繁殖行为和RNAi的害虫防治新途径的探索提供研究思路和靶标基因。

本研究通过基因克隆、功能分析、基因表达、信号转导及目标基因RNAi结合转录组差异分析，阐明了斜纹夜蛾内速激肽Natalisin（NTL）及其受体在斜纹夜蛾生殖调控中的重要功能，解析了NTL及其受体信号系统调控斜纹夜蛾生殖行为的分子机制，总结如下：. 首次克隆斜纹夜蛾NTL及其受体A32基因。此外，还克隆了与NTL功能可能相关的一些其他基因，例如生物钟相关基因CRYs。采用qPCR技术对这些基因在不同处理、不同发育时期和不同组织中的表达进行了分析。通过异源表达及配体-受体信号分析，鉴定了斜纹夜蛾NTL/A32 G蛋白偶联受体信号传递系统。. 首次在斜纹夜蛾中建立了细菌介导的RNAi体系，该技术一方面可以广泛应用于基因功能研究，也是一种很有潜力的下一代害虫防治新型分子农药。并用此技术成功沉默了NTL和A32的表达。沉默NTL或A32的表达均显著影响了斜纹夜蛾雌雄成虫的生殖行为和生殖力，包括求偶、召唤和交配行为下降，产卵量及后代数量下降，表明NTL及其受体在斜纹夜蛾生殖调控中的承担了重要功能。截至目前，前人研究只在果蝇和赤拟谷盗以及桔小实蝇三种昆虫中鉴定了NTL的功能，因此，本研究属于首次在鳞翅目昆虫中阐明了NTL的功能。. 进一步通过NTL RNAi并结合转录组差异分析，发现NTL RNAi均引起了生殖相关基因表达变化。雄虫中发现了4个生殖相关基因表达下调，没有发现生殖相关基因上调情况。雌虫中发现了15个生殖相关基因表达下调，下调幅度较大，也发现了6个生殖相关基因表达上调，但上调幅度相对较小。另外还发现了一些与生殖无关的基因的显著上调，例如一些与免疫相关的基因，这可能与营养权衡机制有关。另外CRY1 RNAi显著影响了NTL及其他脑神经肽的表达。这些结果表明NTL可能通过G蛋白偶联受体信号通路来调节其他生殖相关基因的表达从而达成其生殖行为调控目的，而NTL的合成可能受到生物钟的调节。. 本研究较好的完成了项目计划内容并达到了预期目标。