MAPKs信号转导通路调控血肿瘤屏障紧密连接及开窍药的干预效果和机制研究

血肿瘤屏障(BTB)是限制抗肿瘤药物治疗神经胶质瘤等颅脑肿瘤的关键，紧密连接(TJ)蛋白是BTB结构和功能的基础，MAPKs通路为参与调控TJ蛋白的关键环节。中药开窍药具有"引药上行"，辅助其他药物发挥治疗的作用。课题组前期研究已证实冰片、麝香等能通过改变TJ结构，增加不易透过BTB药物的组织浓度，提高疗效。推论开窍药可能经MAPKs通路调节TJ蛋白来改善BTB的通透性，增强抗肿瘤药物的组织转运。本项目拟以动物实验观察开窍药应用前后抗肿瘤药物的治疗效应、组织生物利用度的变化以及BTB通透性、TJ蛋白分布/表达、MAPKs通路中相关因素的改变，在细胞模型中，通过拮抗相应环节，明确与MAPKs通路相关的TJ蛋白的调控机制以及开窍药对该通路的调节作用，从而阐明开窍药提高抗肿瘤药物组织转运的机制及量效、时效性，诠释并丰富其"芳香开窍，引药上行"的科学内涵，也为临床上颅脑肿瘤的治疗开辟一条新的途径。

血肿瘤屏障(BTB)是限制抗肿瘤药物治疗神经胶质瘤等颅脑肿瘤的关键，紧密连接(TJ)蛋白是BTB结构和功能的基础，MAPKs通路为参与调控TJ蛋白的关键环节。中药开窍药是治疗脑部疾病的常用药物，具有“引药上行”，辅助其他药物发挥治疗的作用。本课题首先通过肿瘤细胞原位种植，建立C6脑胶质瘤大鼠模型，观察开窍药的代表药物—冰片对抗肿瘤药物顺铂、甲氨蝶呤脑组织生物利用度的影响及冰片对BTB通透性、TJ蛋白分布/表达影响的量效、时效关系；进一步利用C6大鼠胶质瘤细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC），非接触培养建立体外BTB模型，研究冰片调控BTB渗透性、TJ蛋白的信号转导通路及分子机制。研究结果显示，C6脑胶质瘤大鼠模型上，低剂量冰片（35mg/kg）、高剂量冰片（140mg/kg）均能显著降低顺铂、甲氨蝶呤的血浆生物利用度、提高脑组织生物利用度，且存在剂量依赖趋势。同时，qPCR、western blot 及免疫组化研究显示冰片能可逆性地下调C6脑胶质瘤大鼠肿瘤区的TJ相关蛋白ZO-1、F-actin的基因及蛋白表达/分布，30-45min时作用效果最显著，120min基本恢复正常水平，但对Occludin、Claudin-5的基因和蛋白表达没有显著影响；体外BTB模型上，首先验证了能冰片能可逆性地调节BTB模型通透性及TJ蛋白ZO-1、F-actin、Claudin-5的分布和表达，进一步研究发现冰片调控TJ蛋白及BTB通透性与提高ERK MAPK信号通路的磷酸化水平相关，而与p38 MAPK及JNK MAPK信号通路没有直接的相关性。随后利用特异性抑制剂U0126和Sorafenib Tosylate，对冰片调控RAF/MEK/ERK信号通路进行深入研究，结果显示冰片可以通过增强RAF1及ERK的磷酸化水平，激活RAF/MEK/ERK信号通路，可逆性地调节BTB紧密连接蛋白ZO-1、F-actin、Claudin-5的分布和表达，进而调控BTB的通透性，呈现剂量依赖趋势。本课题明确了ERK MAPK通路对TJ蛋白表达的调控机制和冰片对该通路、TJ蛋白、BTB通透性的调节作用及量效、时效性，阐明了冰片提高抗肿瘤药物组织转运的效果和机制，丰富了冰片"芳香开窍，引药上行"的科学内涵，冀通过冰片的应用，为临床上颅脑肿瘤的治疗开辟一条新的途径。