Toll样受体调节小胶质细胞活化在氧诱导视网膜新生血管中的作用和机制

Retinopathy of prematurity（ROP）is a devastating disease in premature infants and a major cause of childhood vision impairment. Retinal neovascularization(RNV) is the main pathological characteristic of ROP. It has been identified that in addition to premature delivery, low birth weight and oxygen supplementation, infection/inflammation also participates in the pathological changes in ROP. In our previous study, we found that LPS, a ligand of Toll like receptor 4(TLR4) induce systemic inflammatory response and promote the vasculogenesis of RNV in the animal model of ROP, As well as promoting the activation of microglia cells, which intriguing to conjecture the important role of the inflammation response caused by TLR4 on microglia cells. Allowing for the importance of TLRs in infection/inflammation，we wondered whether other TLRs in addition to TLR4 also affect RNV, and what the underlying mechanism of them in the development of RNV. In this project, we will use the transgenic mice of different TLRs signal deletion and CX3CR1-GFP with oxygen induced retinopathy (OIR) model, by injecting corresponding TLRs agonist/antagonist intravitreally, by using methods of retinal wholemount, fundus autofluorescence, Real-time PCR, immunohistochemistry, and so on, the current study aims to investigate the role of TLRs in the activating of microglia and RNV in vivo and in vitro, as well as the mechanisms of how TLRs take part in RNV.

早产儿视网膜病变（ROP）是造成婴幼儿视力丧失的主要原因，其主要的病理改变是病理性增生的视网膜新生血管（RNV）。近年研究发现，除早产、低出生体重以及吸氧外，感染与炎症可能作为新的致病途径参与ROP的发生发展。本研究组前期工作证实，TLR4的激动剂LPS诱导的炎症可加重动物模型中RNV的生成，并促进视网膜小胶质细胞的活化，提示TLR4介导活化的小胶质细胞参与调控的炎症反应在RNV的发生发展中具有重要意义。而目前对其他多种TLRs是否参与RNV的生成及具体机制尚不清楚。本项目拟选用不同TLR基因敲除型小鼠（TLR-/-）和绿色荧光蛋白特异性标记小胶质细胞小鼠（CX3CR1GFP/ GFP），结合氧诱导视网膜病变（OIR）模型，采用视网膜铺片、眼底自发荧光、PCR和免疫组织化学等方法，在动物体内及体外，明确TLRs对小胶质细胞活化和RNV生成的影响，揭示TLRs参与RNV发生发展的机制。

早产儿视网膜病变（ROP）是导致婴幼儿视力丧失的主要原因，其主要的病理改变是病理性增生的视网膜新生血管（RNV）。近年研究发现，感染与炎症可能作为新的致病途径参与ROP的发生发展。前期研究表明，Toll样受体（TLRs）及其介导的小胶质细胞活化可通过诱导炎症反应参与RNV形成，但机制尚不明确。本研究利用氧诱导的视网膜病变（OIR）小鼠模型，通过使用TLRs的激动剂和抑制剂证实了TLRs介导小胶质细胞活化在RNV中的作用，并进一步探讨了其可能的下游分子机制；此外，通过米诺环素抑制小胶质细胞活化，并利用外泌体分离、高通量测序等技术手段，拓展研究了小胶质细胞及其外泌体在RNV中的作用新机制。本研究所取得的主要结果包括：（1）TLR2和TLR4激活可诱导小胶质细胞活化，增加局部IL-1β和VEGF分泌，加重OIR病变；（2）OIR模型中，TLRs下游通路Caspase-1在小胶质细胞中高表达，促进RNV形成；（3）缺氧诱导小胶质细胞Basigin表达增加，通过PI3K/Akt/IGF-1/VEGFR2信号通路促进RNV形成；（4）使用米诺环素清除小胶质细胞后，OIR病变同样加重，表现为无血管区扩大和RNV形成，小胶质细胞密度与OIR病变相关，提示小胶质细胞对RNV具有双重作用；（5）小胶质细胞分泌外泌体减轻OIR病变和视网膜损伤；（6）miR-24-3p在小胶质细胞外泌体中富集，可通过抑制IRE-1α抑制缺氧状态下内质网应激诱导的光感受器细胞凋亡，并抑制Akt/Erk信号通路抑制光感受器细胞分泌VEGF和TGF-β，从而抑制RNV形成，保护视网膜功能。综上所述，本研究从TLRs分子及下游信号通路入手，结合OIR动物模型及多种干预手段，采用病理学、分子生物学和功能学等指标作为评价体系，探究了TLRs在RNV中的作用及机制，并进一步证实小胶质细胞通过复杂的分子信号网络参与RNV形成，加深了对ROP发病机制的理解，并为ROP的治疗提供新的潜在靶点。